Gene expression monitoring by DNA microarray can provide important information about cell physiology and has the potential to identify connections between regulatory or metabolic pathways that were not previously known. However, due to huge amount of gene expression data and insufficient knowledge on physiology and metabolism of target organisms, the meaningful biological information is hard to get and is often focused on the concerned cellular functions. In this thesis, I carried out gene expression monitoring and transcriptome analysis.
To do these, A microarrayer system was developed for manufacturing E. coli microarrays. The 3-axis robot was designed to automatically collect samples from 96- or 384-well microtitre plates using up to 16 simultaneously moving pens and to deposit them on a surface-modified slide glass. This is followed by a wash/dry operation in a clean station. The cycle is repeated with a new set of samples. This system can deposit cDNA or oligonucleotides with spot intervals of 150 μm and the spot size of 80 μm, thus allowing a high density DNA chip containing about 5,000 spots per cm2 to be made. The entire procedure is controlled by the Visual C++ program that was written in our laboratory by using a personal computer with Pentium 100 CPU. For manufacturing E. coli microarrays, 2,850 genes including all functionally known and putative ones were selected amplified by the polymerase chain reaction (PCR), and spotted onto poly-L-lysine treated slide glasses.
Fed-batch fermentation of Escherichia coli was carried out by exponential feeding until the cell density reached 74 g dry cell weight/L. Transcriptome analysis was carried out to understand metabolic and physiological changes of E. coli during the high cell density cultivation (HCDC). Out of 2,850 genes analyzed, 690 genes showed gene expression level variation greater than two-fold, and these genes were analysed by self-organizing map and hierarchical clustering. It was found that the expression of genes of TCA cycle enzymes, NADH dehydrogenase and ATPase was up-regulated during the exponential fed-batch period, and was decreased towards the end of cultivation. On the other hand, the expression of most of genes involved in glycolysis and pentose phosphate pathway was up-regulated. The expression of most of amino acid biosynthesis genes was down-regulated as cell density increased, while the expression of elongation factor genes was rather constant. These results suggest that the down-regulation of amino acid biosynthesis genes expression may be a major reason for the reduced specific productivity of recombinant proteins during the HCDC. The expression of chaperone genes increased with cell density, suggesting that high cell density condition itself can be stressful to the cells. The expression of phosphate starvation genes was most strongly up-regulated towards the end of cultivation suggesting that more phosphate needs to be provided to achieve higher cell density and/or to avoid phosphate starvation response. It was also found that $\sigma^E$ (rpoE) plays more important role than $\sigma^S$ (rpoS) at the stationary phase of HCDC. Since most of industrial processes for the production of recombinant proteins and metabolites involve HCDC, the results provided in this study should be invaluable in developing metabolic engineering and fermentation strategies for the improved production of these bioproducts.
For understanding physiology and metabolism of poly-γ -glutamic acid (PGA) producing recombinant E. coli, transcriptome analysis by E. coli microarray and metabolic flux analysis were combined. The information about reactions in the metabolic network for E. coli were collected from the literature and EcoCyc database. The metabolic network is represented by 436 metabolites and 644 reactions. 198 of reversible reactions were divided into two positive reactions in opposite directions.
Overall correlation coefficient between transcript levels and fluxes was 0.3, which shows only qualitative correlation. However, as for the central metabolic pathway, glycolysis, pentose phosphate pathway and TCA cycle, and respiration, correlation coefficient scored 0.58 and genes involved in these pathways seemed to be moderately correlated between transcript levels and fluxes. In the transcriptome analysis, phage-shock proteins (pspABCDE), cell division protein (ftsQAL), relA, and NtrC regulated genes which are activated under nitrogen limitation, were highly up-regulated. Based on the analysis of transcriptome and metabolic distribution, we enhanced the PGA production from 0.48 to 3.75 g/L.
DNA microarray를 이용한 유전체 발현 연구 (gene expression monitoring)는 세포내 대사활동에 중요한 정보를 제공할 뿐만 아니라, 기존에 알려지지 않은 대사회로와 조절기작 간의 연결고리에 대한 단서를 제공할 수 있다. 하지만, DNA microarray 실험에서 얻어지는 방대한 양의 데이터와 대상 유기체내의 대사활동과 생체활동에 대한 부족한 지식으로 인해 생물학적으로 의미 있는 정보를 얻기란 그리 쉽지 않아 대부분의 경우 특정 세포작용에 대한 분석에 그치게 된다. 본 연구에서는 유전체 발현 실험을 수행하고 다양한 분석기법을 통해 DNA microarray 실험 데이터를 분석하였다.
고밀도의 DNA microarray의 제작을 위해 DNA microarray 자동제조장치 (DNA microarrayer)를 개발하였다. 2축과 1축의 robot slide의 조합으로 이루어졌으며, 96- 또는 384-well plate에서 시료를 loading후 spotting, washing, drying의 일련의 DNA microarray 제작과정을 자동화하고, 이의 구동을 위한 프로그램을 제작하였다. 본 시스템은 150 μm 의 spot간 간격 (center to center)으로 spot 직경이 80 μm로 찍을 수 있어 1cm2 당 5,000개의 spot을 포함하는 고밀도의 DNA microarray를 제작할 수 있다. E. coli microarray를 제작하기 위해 그 기능이 알려지거나 예상되는 대장균 유전자 2,860 종을 PCR로 증폭하고, 개발된 DNA microarrayer로 poly-L-lysine으로 코팅된 유리 glass에 이들을 고정화하였다.
제작된 E. coli microarray를 이용하여 세포농도에 따른 대사활동과 세포작용의 변화를 알아보기 위해 exponential feeding기질공급전략으로 유가식 배양에 의한 고농도 배양과 gene expression monitoring 실험을 수행하였다. 관찰된 2,850개의 유전자 중 690 개의 유전자의 발현이 세포농도에 따라 2 배 이상의 변화를 보였으며 유전자 발현의 기본 특성을 알아보기 위해 Self-Organizing Map (SOM)과 hierarchical clustering, 그리고 principal component analysis (PCA)를 수행하였다. TCA cycle, NADH dehydrogenase, ATPase 유전자들의 발현이 기질공급 기간 동안 높아지고 발효 후반기에는 감소한 반면 glycolysis와 pentose phosphate 경로 유전자들은 후반기에만 증가하였다. 세포농도가 증가하면서 대부분의 아미노산 합성 유전자들의 발현이 저해되어 고농도 배양시의 재조합단백질의 생산성 저하는 이에 기인한 것으로 보인다. 세포 농도의 증가에 따른 chaperone 유전자의 발현은 고농도배양조건이 세포에 stress를 줌을 알 수 있었다. 발효 후반기의 phosphate starvation 관련 유전자의 급격한 발현 증가는 세포농도에 따른 phosphate의 수율 감소에 따른 것으로 보이며, 고농도의 발효를 위해서는 더 많은 phosphate를 추가시켜야 할 것이다. 발효 후반기에서의 rpoE 와 관련 유전자의 높은 발현과 rpoS의 미미한 발현량 변화는 고농도 배양에서의 rpoE의 역할이 rpoS보다 중요함을 보여준다. 재조합 대장균과 대사산물의 산업적 생산을 위해 고농도 배양이 거의 필수적으로 이용됨을 고려해 볼 때 본 연구에서 얻어진 transcriptome 데이터는 대사공학과 발효전략에 매우 중요하다 할 수 있다.
재조합 대장균에서 생분해성 고분자인 폴리글루탐산 (poly-γ -glutamic acid, PGA) 를 과량생산시의 세포내의 대사활동과 세포작용의 변화를 관찰하였다. PGA를 생산하는 재조합 대장균의 유가식 배양에 의한 발효를 수행하고, PGA생산균주와 비생산균주간의 유전자 발현 정도를 비교 분석하였다. 또한 각 조건에서의 metabolic flux를 계산하여 DNA chip 데이터 분석에 적용하였다. 관찰된 2,850개의 유전자 중 PGA 생산조건에서 196개의 유전자의 2배이상 발현되었으며, 217개가 1/2 이하로 발현이 저해되었다. 높게 발현된 유전자 중에는 nitrogen regulatory protein C (NtrC)에 의해 activation 되는 유전자로 알려진 glnALG (glutamine synthetase, NtrC, and NtrB), glnK-amtB ( an alternate PII and an ammonia transporter), nac (nitrogen assimilation control), 과 amino acid transporter genes (gltJK: glutamate-aspartate, glnH: glutamine, argT: arginine, hisP: histidine). potF (putrescine transport), cbl (regulator for sulfur metabolism)이 포함된다. 특히, glnK 와 amtB의 발현은 각각 55배, 23배 증가하는 등, 이러한 유전자들이 높은 발현 (up-regulation)을 보임으로써 PGA 생산 배양 조건이 질소원 고갈 (nitrogen limitaion) 상태임을 알 수 있었다. 세포분열 유전자인 ftsA, ftsQ, ftsL과 stringent response 반응의 주요역할을 하는 relA의 높은 발현은 PGA 생산에 따른 세포 성장 속도 저해에서 기인한 것으로 보인다. Phase-shock protein인 pspABCDE operon의 과량발현은 세포주변에 PGA로 형성된 capsule이 형성되어 proton motive force가 떨어짐으로써 이의 극복을 위한 것으로 보인다. 또한, 정확한 대사회로 분석 (metabolic flux analysis, MFA)을 위해 문헌과 대사회로 데이터베이스 (EcoCyc/MetaCyc, http://ecocyc.org/)를 검색하여 총 644개의 metabolic reaction (이중 198개는 reversible reaction)과 436개의 대사산물 (metabolites) 정보를 얻었다. 198개의 가역반응은 각각 반대반향으로 향하는 2개의 비가역 반응으로 보아 842개의 reaction 과 198개의 대사산물로 구성된 reaction network를 구성하고, linear optimization 기법을 적용하여 PGA 생산조건과 비생산조건에서의 flux 분포를 예측하였다. MFA에 의해 예측된 flux와 mRNA level의 상관관계는 correlation coefficient가 전체적으로는 0.3로 낮게 나타났다. 하지만, 주요 metabolic pathway인 glycolysis, pentose phosphate pathway, TCA cycle 과 respiration 에 대해서는 0.58로 나타나 이들에 대해서는 moderately correlated 됨을 알 수 있었다. 아미노산 합성 경로에 대해서는 0.07로 나타나 복잡한 amino acid 합성 유전자의 regulation 기작이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 유가식 배양시 질소원을 기질 공급액에 포함시킴으로써 PGA 생산을 0.47 g/L에서 3.75 g/L로 8배 향상시킬 수 있었다.
