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Functional analysis of dMed6 in development of drosophila melanogaster = 초파리 발달과정에 관여하는 전사 매개체 인자인 dMed6의 기능
서명 / 저자 Functional analysis of dMed6 in development of drosophila melanogaster = 초파리 발달과정에 관여하는 전사 매개체 인자인 dMed6의 기능 / Byung-Soo Gim.
저자명 Gim, Byung-Soo ; 김병수
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2001].
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A multi-protein Mediator complex consisting RNA polymerase II holoenzyme is required for both general and regulated transcription in Saccharomyces cerevisiae and higher eukaryotes. A Mediator of higher Eukaryotes like Drosophila and human is consisted of a subset of proteins conserved within metazoans and the other subset of proteins that are conserved throughout development. The MED6 is one of the evolutionary conserved subunit of Mediator complex and required for the regulation of about 10% of whole yeast genome (DNAchip data from yeast, Holstege et al., 1998). To identify the function of the mediator in higher eukaryotic developmental regulation, we clone dMed6, a Drosophila homolog of yeast and human Med6. dMED6 protein was localized in most cell nuclei of Drosophila embryo and ovary. The dMed6 proteins were associated with high-molecular weight complex as yeast and human counterparts and coimmunoprecipitated with other Mediator component. dMed6 mutants were isolated from F2 lethal screening from random mutagenized lethal mutation in dMed6 locus. $dMed6^{26}$ had splicing junction mutation result in truncation of protein and $dMed6^{64}$ had 5 bp deletion in exon 2 also result in truncation. The $dMed6^{26/26}$ could develop to larva like wild type. However, their development were delayed and most of them died as a $3_rd$ instar larva whereas wild type isogenic line could develop to pupa and adult. In fact, the dMED6 protein that was maternally provided was totally disappeared 3 days after egg laying (AEL). That indicated $dMed6^{26}$ is a null mutation. Yeast flipase and recognition sequence (FLP-FRT) mediated clonal analysis on eye and wing imaginal disc showed that $dMed6^{26/26}$ clone could not undergo proliferation. Clonal analysis on ovary shows inappropriate follicle and germ cell division. $dMed6^{26/26}$ expression profile of 192 genes showed that genes required for cell proliferation (cdc2, son of sevenless, and rolled), metabolism (glutamine synthetase, larval serum protein, alcohol dehydrogenase, and cytochrome P450), and transcriptional regulation(Mediator subunits, heat shock factor, dorsal, and ecdysone pathway) are highly compromised. Those data were confirmed by quantitative reversetranscriptase mediated polymerase chain reaction (RT-PCR). $dMed6^{26/26} 3_rd$ instar larva had small or no imaginal discs, half-size salivary gland, brain (CNS), gonads, and slightly vacuole structure fat body whereas their polyploid cell seemed that normal including gut, muscle, epidermis, etc. in contrast to normally developed wild type tissues. $dMed6^{26/26}$ expression profiles analysis with LacZ reporter construct under the control of developmentally regulated promoters showed the requirement of dMed6 for tissue specific transcriptional activation in vivo. The genes required for cell proliferation (CycE, EGFR, and spi) and dorso-ventral or antero-posterior axis and boundary formation (18w, ap, and pka-c1) were severely compromised in optic lobe whereas CNS-specific dpp promoter was not affected. Expression of Cam in ring gland and Kr in fat body was also severely compromised. Therefore, These results suggest that dmed6 highly associates with the gene expression of cell proliferation.

진핵세포 리보핵산 중합효소 Ⅱ (eukaryotic RNAP Ⅱ)의 홀로 효소 (holo-enzyme)는 효모에서 기본(basal) 정도(level)의 전사(transcription)뿐만 아니라, 활성화된(Activated) 전사에도 모두 필요한 여러 개의 단백질로 구성된 복합체입니다. 여러 구성 요소 중 특히 Med6가 주목 받는 이유는 진화적으로 보존되어 왔을 뿐만 아니라 효모에게는 Pol II 전사활성인자의 작용에 없어서는 안될 중요한 요소이기 때문입니다. 발생학적으로 여러 단계에서 그 작용을 할 것으로 기대되는 Med6를 연구하기 위해서, 이미 그 유전자서열이 밝혀진 효모(S. cerevisiae)와 선충(C. elegans) 그리고 사람(H. sapiens)의 MED6 단백질의 아미노산 서열을 정렬하여 보니 보존되어 왔다는 것을 바탕으로 초파리에도 존재하리라 가정하고, 아미노산 서열 상동성이 존재하는 부분에 대해서 덜 특이적인 올리고 (degenerate primer)를 만들고 PCR하여 cDNA를 클로닝하고 전체 cDNA(214a.a)와 genomic DNA(4.2kb)의 유전자를 얻을 수 있었습니다. 어떤 발생학적 단계에서 dMed6가 발현되는 지를 알아보기 위해서 항체로 염색실험을 한 결과, 초파리의 난소와 알, 애벌레가 되기 전 유충단계에서 많이 발현되고 있어서 난소와 유충단계에서는 좀더 자세히 어떤 종류의 조직에서 발현되고 있나 알아보기 위해서 해부한 조직을 항체로 실제로 인씨투(in situ) 염색해 본 결과 결과, 초파리 조직의 대부분의 핵에서 발현되고 핵 DNA의 구조와도 동일한 모양을 존재하는 것도 관찰되었습니다. 즉, 어떤 기관 특이성이 없이 모든 핵에서 골고루 발현되고 있었습니다. dMed6의 게놈 DNA 일부로 초파리 침샘 염색체 상에서 염색한 결과, 세 번째 염색체의 85E10-13부분에 위치하고 있었고, 이 부근의 결손 염색체(deficiency)들을 초파리 데이터 베이스에서 조사해 보았더니, 그 중 하나 Df(3R)by10가 dMed6를 포함한 부분이 결손 되어 있었으나 결손부위가 너무 확대되어 있으므로, dMed6 결손 되어 있지 않으나 결손부위가 비슷한 결손염색체 Df(3R)GB104를 보완적인 대조군으로 사용하여 돌연변이를 검색하였습니다. 6,693마리의 EMS로 인한 무작위 결손유전자 (random mutation)를 가진 숫파리 중에서 102계열(fly line)이 Df(3R)by10 염색체와 짝을 이루었을 때 파리가 깨나지 않는 것이었고, 보완적 대조군 Df(3R)GB104와 짝을 이루었을 때는 죽지 않고 파리가 깨나는 것을 골라 내었을 때는 34계열이 최종 후보로 결정 되었고, 이들을 의 상호 보완성 검사(complementary group test) 하여 이들이 11그룹으로 나뉜다는 것을 알았고, 그 중 dMed6+ 10.4kb genomic DNA 절편에 의해서 보완되어 성체까지 자랄 수 있는 그룹(complementation group)이 하나 였고 두 계열(line)이 이에 포함되었습니다. 이러한 두 종류의 독립적 실험(batch)에서 골라낸 돌연변이 유전자들의 변이 위치를 결정하기 위해서 일단 단백질을 만드는 CDS(coding sequence) 내에 어떤 변화가 있는지 알아보기 위해서 각 부분을 PCR 하였고, heterozygote로부터 뽑은 DNA를 이용하여 DCP (Double-strand conformational polymorphism)를 하거나 이들을 cloning하여 SSCP(single-strand conformational polymorphism)로 차이가 있는지 찾아내어 이들의 염기서열을 결정하여 mutation이 dMed6 유전자 내에 존재한다는 것을 재확인하였습니다. 그 결과 $dMed6^{26}$(114 a.a. +11 nonspecific a.a.)은 세 번째 intron의 splicing acceptor site에 치환변형이 , 반면 $dMed6^{64}$(104 a.a.+16 nonspecific a.a.)는 exon3의 5bp 결손이 있어서 이 두 대립유전자(allele) 모두 중간이 잘린 dMED6 단백질밖에 만들 수 없습니다. 먼저 이들을 이용하여 동형 또는 이형접합체 (모든 체세포가 동일 돌연변이 유전자인 것, zygotic homozygous)의 phenotype을 결정하였습니다. 각각의 대립유전자 와 결손 염색체와의 생존성을 조사하여 본 결과 $dMed6^{64}$ 접합성 동형접합체 제외(1-2령기($1^{st}$ and $2^{nd}$ instar larva)에서 죽음)하고는 모두 3령기(3rd instar larva)에서 더 이상 번데기로 전혀 발달하지 못하고 약간 작은 크기에서 머물다가 죽는 것을 관찰 하였습니다. $dMed6^{64}/Df(3R)by10 의 경우 다른 $dMed6^{26}$/Df(3R)by10, $dMed6^{26}$/$dMed6^{64}$와 같이 3령기까지 발달하는 것으로 보아 $dMed6^{64}$는 다른 숨겨진 유전자 변이가 있는 것으로 생각되어 앞으로의 실험은 $dMed6^{26}$로 진행하였습니다. 야생형3령기 애벌레는 이미 성체 기관(imaginal discs)의 발달이 일어나 이미 각 기관이 모양을 어느 정도 갖추게 되고, 그 이외에 애벌레기관(polyploid cell)은 분열을 않고 대신 핵 내 DNA만을 증폭시켜 염색체 다발을 형성하고 세포 크기를 켜지며 성장합니다. $dMed6^{26/26}$ 접합성 동형접합체의 3령기의 애벌레는 성체기관의 형성이 제대로 일어나지 못하고 그밖에 애벌레에서 분열이 일어나는 기관인 암수 생식성선(gonad) 세포들의 분열도 제대로 이루어지지 않는 것을 보았습니다. 그 성체기관 전체 지름이 약 $\frac{1}{4}$밖에 되지 않았는데 이는 야생형이 약 3번 분열할 때 한번 정도 밖에 분열하지 못한 것으로 해석 될 수 있습니다. 이런 분열 못한다는 것을 다시 확인하기 위해 1령기 애벌레의 눈과 날개 성체기관에 그리고 성체의 난소에 동형접합 클론(homozygous clone)을 만들고 약 3~4일 후 관찰한 결과0~2번밖에 분열하지 못하고 마는 것을 보았다. 위 동형접합체의 각 유전자의 발현 정도는 전체 게놈(genome) 단계에서 볼 수 있는 ‘DNA유전자칩’이라는 기술을 이용한 발현 분석(expression profile)을 통하여 어떤 유전자의 발현이 어떻게 영향을 받았는지 보았습니다. 대표적으로 영향을 받는 유전자들에는 세포내 대사(metaboilism), 세포 성장(cell proliferation), 여러가지 유전자발현(trascription factor)에 간여하는 것들이 있었습니다. 이들의 발현양상이 정말로 그런지 알아보기 위해 정량적인 RT-PCR을 여러 유전자에 대해서 시행하고, 약 70% 이상이 정말로 그렇게 발현된다는 것을 확인하였습니다. 또 실제로 각 조직에서의 발현양상을 직접보기위해, 각각의 유전자의 기능활성제를 가로 채는 LacZ 류(enhancer trap LacZ line)와 교접(cross)하여 동형접합체 (homozygous) 내에서 발현될 수 있도록 한 뒤, 그 발현 정도를 이형접합체(heterozygous)와 비교하여 보았습니다. 기관들 중에서 야생형과 그 형태적 발생에 있어서 크게 차이가 없는 초파리의 중추신경계에서 그 발현들을 먼저 살펴 보았는데, 분열하는 세포에서 주로 발현되어 세포주기에 관여하는 CycE와 성장호르몬의 일종인spitz또 성장호르몬 수용체인 EGFR의 경우 현저히 발현 양이 줄어든 것을 보았고, 원래 그 시기에서 발현유도 되는 유전자들인 각 기관 축 형성(Axis determination genes: apterous, 18 wheeler) 의 발현은 양이 약간 줄긴 했으나 현저하진 않고 발현부분은 정상적인 것(decapentaplegic)도 있음을 알았습니다. 또한 동형접합체의 창자(gut)와 같은 기관처럼 크게 형태로 볼 때 거의 차이가 없는 기관에서도 발현양이 크게 차이가 없는 것(PKA-CA과 zipper)으로 보아 각 기관발달의 dMed6 의존도가 차이가 나는 것을 관찰하였습니다. 형태적으로 약간은 세포내 수포들이 더 커진 것 이외는 차이가 없는 기관인 지방체(fat body)에서 야생형에서 발현되던 Krüppel 발현이 안되는 현상을 관찰하였습니다. 모든 결과들을 종합하여 볼 때, dMed6는 많은 종류의 유전자 발현에 관여하여 그 발현 정도를 직접적으로 조절하는 유전자라는 것을 알 수 있었고, 또한 dMed6가 생체 내에서 사람이나 효모, 그리고 선충류와 같이 커다란 복합체를 형성한다는 연구결과로 미루어 직접적으로 각각의 유전자 발현에 간여하는 전사 활성인자에 직접 작용하여, 전사활성정도를 조절하는 중요한 인자임을 알게 되었습니다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 01016
형태사항 vi, 124 p. : 부분색채삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김병수
지도교수의 영문표기 : Chang-Won Kang
지도교수의 한글표기 : 강창원
수록잡지명 : "Drosophila Med6 is required for elevated expression of large but distinct set of developmentally regulated genes.". Molecular and cellular biology, v.21no.13, pp.0000-0000 (2001)
수록잡지명 : "Drosophila mediator complex is broadly utilized by diverse gene-specific transcription factors at different types of core promoters.". Molecular and cellular biology, v.21no.7, pp. (2001)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 98-115
주제 transcription
mediator
Drosophila
dMed6
DNA chip
전사
매개체
초파리
발달
디엔에이칩
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