Escherichia coli, gram negative bacteria, contains two membrane (inner and outer membrane) and can be divided three compartments by these two membrane: cytoplasmic, periplasmic, and extracellular space. The production of recombinant proteins are targeted to one of these three compartments and the mode of gene expression affects the location of the protein produced. In this study, expression systems for the new efficient expression system of recombinant proteins in three compartments of E. coli were developed.
Firstly, the efficient expression system into cytoplasmic space of E. coli was developed. Human leptin was produced as inclusion body using T7 promoter in E. coli BL21(DE3). In the fed-batch fermentation with induction at OD=90, 9.7 g/L (37.5 % of total proteins) of leptin was produced. After simple purification steps, 144.9 mg of leptin with a purity of greater than 90% was obtained from the 50 mL culture with a recovery yield of 41.1%.
Secondly, the efficient expression system for the secretory production into periplasmic space of E. coli was developed. Human leptin was produced efficiently into the periplasmic space of E. coli using endoxylanase signal peptide. Under Trc promoter, human leptin was secreted successfully into periplasm, and the efficiency of secretion was as high as 95%. However, most of secreted leptin (about 90%) formed the insoluble inclusion body in the periplasm of E. coli. Using periplasmic foldase (DsbA), 69% of secreted leptin was produced as soluble form. Recombinant fusion hG-CSF protein was secreted into the periplasmic space of E. coli using endoxylanase signal peptide. Using modified gene sequence in N-terminal of hG-CSF gene, hG-CSF protein was accumulated up to 48% of total proteins in cytoplasm of E. coli. Fusion of signal peptide directly to hG-CSF protein caused cell lysis after inducion. However, insertion of small peptide (13 a.a.) between the signal peptide and the mature protein allowed the high production of hG-CSF fusion protein (20-22% of total protein) with the secretion efficiency greater than 98%. Finally, the efficient expression system for the extracellular production into culture medium was developed. Human β-endorphin was produced efficiently in culture medium using OmpF fusion system. By high cell density cultivation with E. coli BL101 ($ompFβ^-$ strain) harboring pOmpF6βE, OmpF-β-endorphin fusion protein was produced in culture medium as high as 4.5 g/L. β-endorphin from fusion protein could be purified through easy and efficient purification process.
그람 음성 박테리아인 대장균 (Escherichia coli)은 두개의 세포막을 갖고 있으며 이 두막에 의해 세구역 - 세포질(cytoplasm), 주변세포질 (periplasm), 세포외 (extracellular) - 으로 구분이 될 수 있다. 대장균에서 재조합 단백질의 생산은 이 세 구역중의 하나로 정해질 수 있으며, 사용하는 발현시스템에 따라 각각의 구역으로 생산이 결정되게 된다. 본 연구에서는 대장균의 세 구역으로의 효율적인 재조합 단백질 생산 시스템을 개발하였다.
첫번째로 대장균의 세포질내로의 효율적인 단백질 생산 시스템을 개발하였다. 인체 비만 단백질 (leptin)을 T7 promoter를 이용하여 대장균 BL21(DE3) 균주에서 세포질내에 불용성 응집체 (inclusion body) 형태로 생산하였다. 고농도 배양시 OD=90의 세포농도에서 유도발현을 수행하였을 때, 9.7 g/L의 (전체단백질의 37.5%) 비만단백질을 생산할 수 있었다. 간단한 정제 및 재접힘 (refolding) 과정을 통하여 고농도 배양액 50 mL로부터 비만단백질 144.9 mg을 순수분리 할 수 있었다.
두번째로 대장균의 주변세포질로의 효율적인 분비생산이 가능한 발현 시스템을 개발 하였다. 고초균 (Bacillus sp.)에서 유래한 endoxylanase signal peptide를 이용하여 인체 비만 단백질을 대장균의 주변세포질로의 효율적인 분비생산이 가능하였다. Trc promoter를 이용하여 분비생산을 시도한 결과 전체단백질의 40%에 해당하는 비만단백질을 고효율 (분비효울 95%이상)로 분비생산 할 수 있었다. 그러나 대장균의 주변세포질에 분비생산된 대부분의 비만 단백질은 주변세포질에서 불용성 응집체를 형성하였다. 이를 해결하기 위하여 대장균의 주변세포질에서 단백질 접힘 (folding)에 관여하는 DsbA 단백질을 동시생산하였으며 이를 통하여 분비단백질의 약 69%를 수용성 (soluble) 단백질로 생산할 수 있었다. Endoxylanase signal peptide를 이용하여 인체유래 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)의 분비생산도 가능 하였다. G-CSF의 N-terminal의 변형유전자를 사용하여 대장균에서 발현 효울을 증가시켰으며 이를 이용하여 분비생산을 시도하였다. 그러나 signal peptide와 G-CSF 유전자의 직접적인 연결을 통한 분비발현은 대장균의 용해 (cell lysis)를 일으켰다. 이의 해결과 생산후 분리정제를 용이하게 하기위하여 histidine hexmer (His6)가 포함된 13개의 아미노산으로 구성된 올리고펩타이드(oligopeptide)를 signal peptide와 G-CSF 단백질 사이에 삽입하였으며 이를 통하여 전체단백질의 20-22%에 해당하는 G-CSF 융합 단백질의 분비생산이 가능하였다 (분비효율 98% 이상).
마지막으로 대장균 배양액으로의 효율적인 분비생산이 가능한 발현 시스템을 개발 하였다. OmpF 융합 시스템을 이용하여 인체 β-endorphin 세포배양액으로 분비생산하는데 성공하였다. 대장균 BL101 (pOmpF6βE)의 고농도 배양을 통하여 4.5 g/L 농도의 OmpF-β-endorphin 융합 단백질을 세포배양액으로 분비생산 하였다. 단순하고 효율적인 정제과정을 통하여 β-endorphin을 순수 분리할 수 있었다.
