Pseudomonas fluorescens is a gram negative psychrotrophic bacterium which secretes a thermostable lipase into the extracellular medium. During the previous study, the lipase of P. fluorescens SIK W1 was found to have a potential C-terminal signal sequence and be secreted by ABC transporter. Genetic loci around the lipase gene were searched and secretory genes were identified. Nucleotide sequencing of a 8.5 kb DNA fragment revealed the three components of the ABC transporter, tliD, tliE, tliF upstream of the lipase gene, tliA. In addition, genes encoding a protease and a protease inhibitor were located upstream of tliDEF. In this study, we examined whether the ABC transporter was responsible for secretion of the protease and could be used for secretion of foreign protein which was not secreted in E. coli. We found that P. fluorescens SIK W1 secreted this protease. When the protease gene (prtA) and ABC transporter genes (tliDEF) were introduced in E. coli, the recombinant strain could also secret the protease. And when both the protease gene and ABC transporter genes were introduced additionally into P. fluorescens SIK W1, the secreted protease was increased by ten fold compared to wild type strain. In addition, when both the C-terminal signal sequences of the protease and lipase were fused to the Proteus vulgaris K80 lipase which was not secreted in E. coli, the fusion lipase had lipase enzyme activity. And E. coli harboring the fusion lipase gene and tliDEF gene secreted the fusion lipase to the culture medium. This results demonstrated that we can secrete the enzyme which was not secreted to culture medium, having enzyme activity, if we use the C-terminal signal sequence and P. fluorescens SIK W1 ABC transporter.
Pseudomonas fluorescens는 내열성 리파제를 세포밖으로 분비하는 저온성 그람음성균이다. 본 실험실에서는 P. fluorescens SIK W1의 리파제 유전자를 클로닝하여 염기서열을 밝혔다. 여기서 추론된 리파제의 염기서열을 분석한 결과, 리파제는 대부분의 분비되는 단백질이 가지는 N-말단 신호서열을 가지지 않았다. 오히려 C-말단 쪽에 ABC transporter에 의해 인식되어지는 신호 서열이 존재하는 것이 밝혀졌다. 리파제 유전자의 앞 뒤부분의 유전자를 찾아 본 결과, 분비유전자가가 존재하는 것을 밝혔다. 8.5kb의 염기서열을 밝혀낸 결과, 리파제 유전자 (tliA) 앞에 ABC transpoter의 3개의 유전자인 tliD, tliE, tliF가 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한 단백질분해효소 유전자 (prtA)와 그의 저해 단백질 유전자 (inh)가 3개의 ABC transporter 앞에 존재함을 알 수 있었다. 본 실험에서, P. fluorescens SIK W1은 이 단백질 분해효소를 세포 밖으로 분비함을 밝혔고, 단백질 분해효소와 ABC transporter 유전자를 서로 다른 플라스미드에 넣어 대장균에 도입했을 때, 이 대장균 역시 세포 밖으로 단백질분해 효소를 분비함을 알 수 있었다. 그리고 단백질 분해효소와 ABC transporter 유전자를 서로 다른 플라스미드에 넣어 P. fluorescens SIK W1에 도입했을 때, 이 균주가 분비하는 단백질분해효소의 양이 이 두 유전자를 도입하지 않은 P. fluorescens SIK W1이나, 이 두 유전자를 도입한 대장균에 비해 10배 이상 많음을 알 수 있었다. 또한 단백질분해효소와 리파제의 C-말단에 존재하는 신호서열을, 대장균에서 세포밖으로 분비되지 않는 Proteus vulgaris K80에서 유래한 리파제에 fusion한 결과, 이 신호서열과 fusion된 리파제가 효소활성을 가짐을 확인했고, 이 리파제 유전자와 ABC transporter 유전자를 E. coli에 도입한 결과, 이 E. coli가 리파제를 세포 밖으로 분비함을 알 수 있었다. 위의 결과로부터 ABC transporter에 의해 인식되어 지는 신호 서열을 세포 밖으로 분비되지 않는 효소에 fusion시켜, ABC transporter유전자와 함께 대장균에 도입했을 때, 이 fusion된 효소가 효소활성을 가지면서, 세포 밖으로 분비될 수 있음을 알 수 있었다.
