A DNA and RNA helicase was purified from extracts of Schizosaccharomyces pombe to near homogeneity. The helicase activities copurified with a 95-kDa polypeptide upon a SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Determination of its partial amino acid sequence and molecular masses of its trypsin-digested peptides revealed that the enzyme is homologous to the SEN1 gene product of Saccharomyces cerevisiae, an essential protein affecting a variety of RNA metabolisms in a global fashion including endonuclease cleavage of introns from precursor tRNAs in yeasts. Thus, the purified enzyme was named SpSen1p (Sen1p of Schizosaccharomyces pombe). This study first demonstrated that SpSen1p is indeed a DNA and RNA helicase as inferred from the fact that SEN1 of Saccharomyces cerevisiae shares sequence homology to Upf1, previously known as an RNA and DNA helicase. In addition, various biochemical parameters associated with the enzyme were determined in detail. The helicase utilized partial duplex substrates with free 5'-single-stranded tails, demonstrating that it translocated with the exclusive directionality of a 5' to 3'. SpSen1p was capable of unwinding all four combinations of DNA and RNA duplexes. In agreement with this observation, SpSen1p hydrolyzed ATP in the presence of either DNA or RNA as cofactor. Among polynucleotide cofactors tested, yeast tRNA was least efficient in supporting ATP hydrolysis of SpSen1p. RNA substrate was unwound more efficiently (2-fold) by SpSen1p than DNA substrate in the absence of salt. However, in the presence of salt (25-50 mM), both DNA and RNA substrates were unwound equally well. The enzyme has higher affinity (5-8 fold) towards single-stranded DNA than single-stranded RNA, whereas RNA was preferred substrates for unwinding. This observation indicates that stronger affinity towards DNA could hinder the enzyme's ability to translocate along DNA, thereby lowering unwinding efficiency of DNA substrate. Purification of a larger version (181 kDa) of enzyme resolved the molecular weight discrepancy between the purified enzyme (95 kDa) and the predicted protein (192.5 kDa). The large enzyme has identical biochemical properties, such as substrate specificity, directionality, salt sensitivity, and cofactor requirements, although it displayed some differences in column behavior. The purified 181-kDa polypeptide was detected by polyclonal antibody that raised against truncated polypeptide containing the most carboxy-terminal 195 amino acids. These suggest that the 95-kDa enzyme was a proteolyzed product of approximately 830 amino acids at the carboxy-terminus of the full length enzyme. On the basis of these findings, this study proposes the relevance of its biochemical activities to seemingly divergent roles of Sen1 in RNA transactions that include precursor tRNA splicing.
분열효모 (Schizosaccharomyces pombe)의 세포 추출액에서 DNA 및 RNA helicase를 고순도로 정제하였다. SDS-polyacrylamide 젤상에서 전기영동법으로 분석한 helicase의 분자량이 95-kDa이었다. 일부 아미노산 서열 분석 결과와 trypsin 분해 단편의 분자량 분석 결과에 의해 이 효소가 효모 (Saccharomyces cerevisiae)의 SEN1 유전자 산물과 아미노산 서열상 상동 관계임이 밝혀졌다. Sen1 단백질은 효모에서 tRNA 전구체로부터 intron을 잘라 제거하는 기능 외에도 다양한 RNA 대사에 관여하며, 생장에 필수적인 것으로 알려져 있다. 실제 정제한 단백질 분자량 (95 kDa)과 분열효모 SEN1 유전자로 추정한 분자량 (192 kDa) 사이의 불일치는 더 큰 효소 (181 kDa)를 고순도로 정제해 냄으로써 해결되었다. 이 181-kDa 효소는 95-kDa 효소와 정제과정에서 차이점을 보여주었지만, 생화학적 특성, 예를 들어 기질 특이성, 이동 방향성, 염 민감성, 및 조요소 요구성이 동일하였다. 아울러 이 큰 효소는 C-말단의 195개 아미노산만으로 구성된 펩티드로 생성시킨 복합항체와 면역학적으로 반응하였다. 이 사실로 95-kDa 효소가 N-말단 일부가 잘려나가 C-말단에서부터 약 830개 아미노산만으로 구성된 것임을 알 수 있었다. 따라서 우리는 정제한 효소를 분열효모의 Sen1 단백질 (SpSen1p)로 명명하였다. 본 연구는, 이미 RNA 및 DNA helicase로 알려진 효모의 Upf1 단백질과 아미노산 서열상 상동관계에 있는 Sen1 단백질이 실제로 RNA 및 DNA helicase 활성을 가진다는 사실을 처음으로 밝혔다. 또한 이 효소가 갖는 여러 가지 생화학적 성질을 자세히 밝혔다. 이 효소는 DNA 단일가닥 위를 5'에서 3' 방향으로만 이동하며, 4가지 모든 형태의 RNA 및 DNA 이중나선 구조를 풀어 낼 수 있었다. 이 사실은 분열효모 Sen1 단백질이 RNA 및 DNA가 존재하는 조건에서 갖는 ATP 가수분해 능력과 잘 부합하고 있다. ATP 가수분해를 촉진하는 염기복합체 조요소 중에서, 효모 tRNA가 가장 비효율적이며, poly(dA), poly(A), 및 poly(U)가 가장 효율적이었다. 염의 첨가가 없는 조건에서, RNA 이중 나선 기질이 DNA 기질에 비해 2배 더 효율적으로 풀렸다. 그러나 20-50 mM NaCl이 존재하는 조건에서는 두 가지 기질이 동일한 효율로 풀렸다. 정제된 효소는 RNA 단일가닥에 비해 DNA 단일가닥에 더 강하게 (5-8배) 결합하였다. 본 연구에서 밝혀진 분열효모 Sen1 단백질의 생화학적 특성은 이 효소가 어떻게 RNA 대사의 다양한 기능을 감당해 내는지에 대한 실마리를 제공하고 있다.
