In order to find the functional amino acid residues of SP6 RNA polymerase that are potentially involved in transcription termination, we have developed a two vector system that allows for isolating the mutants of phage SP6 RNA polymerase with increased efficiency of termination at the SP6 terminator. Mutations were induced by carrying out the polymerase chain reaction under reduced fidelity condition in N-terminal region (amino acid 1 273) of the SP6 RNA polymerase. From this method, we identified three point mutants (M15L, M15S, and D117G). And we purified the proteolytically cleaved SP6 RNA polymerase in E. coli JM109.
Transcription termination efficiencies of these mutant polymerases over various terminators were measured in vitro with the purified polymerases. At one class of terminators including its own (SP6 terminator and rrnBT1 terminator site A) these mutant enzymes terminated transcription with a higher efficiency than the wild type RNA polymerase. On the other hand, they terminated transcription with a lower efficiency at the rrnBT1 termination site B. And these mutant polymerases were deficient in processivity on long DNA templates. Comparision of the binding products for wild and mutant RNA polymerases with non-specific RNA and SP6 terminator RNA revealed that mutant enzymes have reduced binding activities with non-specific RNA and SP6 terminator RNA, respectively. And the binding activities of mutant RNA polymerases with terminator RNA were lower than with non-specific RNA.
From this study, we suggest that increase of termination efficiency of mutant RNA polymerases at class I terminator is result from the increase of RNA release at termination site.
본 연구에서는 파아지 SP6 RNA 중합효소에서 전사종결 과정에 관여하는 아미노산 잔기를 결정하였다. 이를 위하여 먼저 전사종결 효율이 높아지는 SP6 RNA 중합효소 돌연변이를 표현형으로 골라낼 수 있는 2 벡터체계 (two vector system)를 구축하였다. 돌연변이를 유도하기 위하여 Taq DNA 중합효소의 충실도가 감소된 조건 (20 mM $MgCl_2$, 1 mM dNTP, pH 8.3 실온)과 dITP를 이용하는 조건에서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하여 무작위적으로 돌연변이를 유도하였다. 이 system을 이용하여 전사효율은 야생형과 거의 동일하면서 전사종결 효율이 증가하는 3가지의 돌연변이를 찾을 수 있었다. 이와함께 nick form RNA 중합효소도 정제하여 이들 3가지 돌여변이 RNA 중합효소와 함께 여러 가지 성질들을 규명하였다.
먼저 이들 돌연변이들은 첫 번째 종류의 전사 종결체 (class I terminator: SP6 terminator, rrnBT1 terminator site A)에 대해 모두 야생형보다 높은 전사종결 효율을 나타내었다. 그러나 두 번째 종류의 전사 종결체 (class II terminator: rrnBT1 terminator site B)에 대해서는 모두 야생형보다 낮은 전사종결 효율을 나타내었다.
다음으로 이들 돌연변이들의 processivity를 결정한 결과 긴 template를 사용하였을 때 야생형보다 processivity가 낮아짐을 알 수 있었다. 또한 이들 돌연변이들은 non-specific RNA와의 binding activity가 야생형보다 떨어졌으며 SP6 전사종결체 RNA와의 binding activity도 떨어졌다. 그리고 이들 돌연변이들은 야생형과 비교하였을 때 SP6 전사종결체 RNA와의 binding activity가 non-specific RNA와의 binding activity보다 더 많이 감소하는 것을 알수 있었다.
이 결과들을 종합해 볼 때 이 돌연변이들은 non-specific RNA와의 binding activity가 떨어지므로 긴 template에 대한 processivity가 떨어지게 되고 전사종결 부위에서 야생형 RNA 중합효소보다 더 잘 떨어지므로 첫 번째 종류의 전사종결체 (class I terminator)에서 야생형 RNA 중합효소보다 높은 전사종결 효율을 나타내게 됨을 알 수 있었다.
