To design the scheme of large-scale production of chimeric antibody for the post-exposure prophylaxis of hepatitis B virus (HBV) infection, the stability of transfectomas (H69K-1 and 6-31) regarding antibody production was examined during a long-term, repeated-fed batch culture without selection pressure using antibiotics. Although H69K-1 transfectoma was more stable than 6-31 transfectoma, both transfectomas displayed gradual decrease in specific antibody productivity ($q_Ab$) for the first several weeks of cultivations. During this period, $q_Ab$ was decreased by 40-50%. This loss of $q_Ab$ was mainly due to the appearance of a nonproducing population of transfectoma (NP) which was monitored throughout the culture by flow cytometry and limiting dilution method. However, an NP did not overtake the culture and were balanced with a producing population of transfectoma (P), resulting in stable antibody production. The subclones of NP obtained at the end of long-term culture were further characterized by reverse transcription-polymerase chain reaction assay of the heavy and light chain mRNA. All the subclones of NP derived from H69K-1 transfectoma had only light chain mRNA. On the other hand, an NP in 6-31 transfectoma culture was heterogeneous. Some subclones of NP derived from 6-31 transfectoma had only heavy chain mRNA and other subclones had only light chain mRNA. Taken together, the results obtained here suggest that selection pressure is necessary for a long-term, continuous culture, because stable antibody production in a long-term culture was achieved only after a significant loss of antibody productivity. Accordingly, a batch culture appears to be more appropriate for a large-scale chimeric antibody production without selection pressure.
In the flow cytometric analysis of the stability of antibody-producing cells, fluorescent antibody probes specific for immunoglobulin heavy chains have been widely utilized to quantify intracellular antibodies. To investigate the effect of the specificity of antibody probes on flow cytometric analysis, nonproducing subclones of the 6-31 transfectoma were stained with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-human IgGs specific for heavy chain and light chain, respectively. The use of heavy chain-specific probe identified heavy chain-only producers as producers, whereas the use of light chain-specific probe identified light chain-only producers as producers. Thus, both heavy chain-specific and light chain-specific antibody probes should be used for the accurate evaluation of a heterogeneous nonproducing population. Furthermore, the results of the flow cytometric analysis were confirmed by immunoblotting, suggesting that flow cytometry is a useful technique for the rapid evaluation of the stability of transfectomas producing chimeric antibody.
H69K-NGD, secreting a mouse/human chimeric antibody, showed a linear increase in specific antibody productivity ($q_Ab$) with osmolalities ranging between 280 and 370 mOsm/kg and a saturation level in $q_Ab$ beyond 370 mOsm/kg. To increase medium osmolality, sodium chloride was added to normal IMDM supplemented with 5 % fetal bovine serum (280 mOsm/kg). The increase in $q_Ab$ was accompanied with the cell mass increase determined by dry cell weight and total cellular protein content. However, the extent of $q_Ab$ increase at each osmolality exceeds that of cell mass. To investigate the detailed mechanisms and possible causes of the increase in $q_Ab$ under hyperosmolar conditions, we examined the effect of osmolality on parameters such as transcription, translation, and secretion of antibodies.
Several important changes in cellular responeses were observed as medium osmolality was increased from 280 to 415 mOsm/kg. The steady state level of light chain polypeptide was increasingly accumulated in cell, while that of heavy chain progressively decreased to 70 %. This imbalance of excess light over heavy chains was found to be derived from transcription level of antibody. Although the level of light chain mRNA was slightly elevated with increasing osmolality, the heavy chain mRNAs were decreased, which led to such an increase in light to heavy chain ratio. On the contrary, the translation rate of heavy chains as well as light chains was increased by hyperosmolalities. The elevated $q_Ab$ can be described by higher heavy and light chain synthesis than other non-Ig protein. The saturated $q_Ab$, which were shown in the range of 370 - 415 mOsm/kg, can be explained by a saturated level of total protein synthesis.
Previously reported simulations suggest that the free light and heavy chain ratio is an important parameter which can affect the assembly rate and therefore affect the specific antibody secretion rate ($q_Ab$) during batch culture. However, observed antibody secretion rates were not affected by excess light chains induced by hyperosmolalities.
B형 간염 바이러스에 대한 치료용 재조합 항체의 대량생산을 위한 첫 단계로, transfectoma 세포주들을 (H69K-1과 6-31) 항생제를 이용한 selection pressure 없이 장기간 반복 유가 배양 (repeated-fed batch culture)하여, 세포의 안정성을 조사하였다. 비록 H69K-1가 6-31보다 좀더 안정적이긴 하지만, 둘 다 초기 몇 주의 배양기간 동안 점진적인 비항체 생산성 ($q_Ab$)의 감소를 보였다. 이 기간에 $q_Ab$는 40-50% 정도 떨어졌다. 이러한 감소는 주로 nonproducing population (NP)의 출현에 기인함을 limiting dilution method와 flow cytometry를 이용한 조사로 알 수 있었다. 그러나, NP는 배양 전체를 overtake하지는 않았고 producing population (P)과 균형을 이루어 배양 후반에는 안정적인 항체 생산을 보였다. 배양의 마지막에 얻은 NP의 subclone들의 항체의 각 heavy와 light chain mRNA에 대한 reverse transcription-polymerase chain reaction assay가 수행되었다. H69K-1에서 유래된 모든 NP subclone들은 모두 light chain mRNA만을 갖고 있는 반면, 6-31의 NP subclone들은 heterogeneous하였다. 6-31의 몇몇 NP subclone들은 heavy chain mRNA만을 갖고 있었고 또 나머지 subclone들은 light chain mRNA만을 갖고 있었다. 결과적으로, 안정적 항체 생산은 항체 생산성의 심각한 감소 후에 이루어지므로 장기간의 continuous culture에는 selection pressure가 필요할 것이다. 따라서 재조합 항체의 대량 생산에는 selection pressure 없이 batch culture하는 것이 좀더 적절할 것이다.
Flow cytometry를 통한 항체 생산 세포주의 분석에는 항체의 heavy chain에 특이적인 fluorescent antibody probe가 주로 사용되어 세포 내의 항체가 검색된다. 이러한 antibody probe specificity의 flow cytometric analysis에 대한 영향을 조사하기 위하여 6-31의 NP subclone들을 각각 heavy chain과 light chain에 특이적인 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-human IgG로 staining하였다. Heavy chain에 특이적인 probe의 사용은 heavy chain-only producer를 producer로 오인하게 하였고 반면에 light chain에 특이적인 probe의 사용은 light chain-only producer를 역시 producer로 오인하게 하였다. 따라서, heterogeneous한 NP의 정확한 평가를 위해서는 heavy chain과 light chain에 각각 특이적인 probe를 모두 사용하여야 한다. 병행 immunoblotting으로 확인된 바에 의하면 재조합 항체 생산의 안정성의 빠른 평가에 flow cytometry는 좋은 방법이었다.
생쥐/인간의 재조합 항체를 생산하는 H69K-NGD는 배지 삼투압이 280에서 370 mOsm/kg로 증가함에 따라 직선적인 비항체 생산성($q_Ab$)을 보이며, 370 mOsm/kg를 넘어서는 포화 된 비항체 생산성을 나타낸다. 배지의 삼투압을 높이기 위해서 NaCl을 5% FBS가 함유된 IMDM (280 mOsm/kg)에 첨가하였다. $q_Ab$ 의 증가는 cell mass의 증가를 수반하는데 이것은 DCW와 세포의 total protein content로 조사되었다. 그러나 $q_Ab$ 의 각 삼투압에서의 증가 정도는 cell mass의 증가 정도를 뛰어 넘는다. 고삼투압 하에서의 $q_Ab$ 증가와 관련된 기작 또는 가능한 원인을 알기 위하여, 항체의 transcription, translation과 secretion등에 대한 배지 삼투압의 영향을 조사하였다.
배지 삼투압이 280에서 415 mOsm/kg로 증가함에 따라 몇몇 중요한 세포 반응의 변화가 관찰되었다. 항체의 light chain polypeptide의 steady state level은 점차 증가된 반면 heavy chain polypeptide는 70%까지 감소하였다. 이러한 light chain의 heavy chain에 대한 불균형은 항체 발현에 있어서 transcription level에서 유래됨이 밝혀졌다. Light chain mRNA는 증가하는 삼투압에 대하여 약간의 증가를 보인 반면 heavy chain mRNA는 오히려 감소하여 heavy chain에 대한 light chain의 비(ratio)의 증가를 유도하였다. 그러나, 삼투압 증가에 대하여 heavy chain과 light chain의 translation rate는 모두 증가하는 것으로 관찰되었다. 따라서 고삼투 환경에 대한 $q_Ab$의 증가는 다른 단백질들의 translation에 비해 향상된 항체 polypeptide의 translation rate로 설명될 수 있다. 그리고 370-415 mOsm/kg에서 보인 포화된 $q_Ab$는 그 구간에서 보인 전체 단백질 합성의 정체로 설명될 수 있다.
보고된 simulation에 의하면 heavy에 대한 light chain의 비(ratio)가 항체의 assembly rate에 중요한 요소로 작용하고 결국 batch culture에서의 $q_Ab$에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 그러나 관찰된 항체의 secretion rate는 고삼투 환경에 의하여 유도된 과다한 light chain에 영향을 받지 않는 것으로 조사되었다.
