A gene, aprP, encoding an extracellular alkaline protease from Pseudomonas sp. KFCC 10818, was expressed in E. coli and the protein product, AprP, was purified to near homogeneity. The molecular weight of the alkaline protease was determined as 29 kDa by SDS-PAGE. The N-terminus of the processed and secreted AprP was identified as Ala-140. The purified AprP was most active at pH 11, which is 0.5-2 pH units higher than those of the known subtilisins. The AprP was stable in the pH range of 6 to 11. The stability of the protease was maintained below 53℃ in the presence of 2 mM $Ca^{2+}$. The optimum temperature of AprP was 60℃, which was shifted to ＞ 70℃ in the presence of 2 mM $Ca^{2+}$. The AprP showed above 50 % of the maximal activity at a low temperature, 15℃. Considering its alkalophilicity and high activity at low temperatures, AprP possesses good characteristics as a candidate for detergent formulation. Moreover, the $k_{cat}/K_m$ value ($9.2 \times 10^3 S^{-1}mM^{-1}$) of AprP for the hydrolysis of Suc-AAPF-pNA was 40 - 1400 times higher than those of subtilisins. Therefore, the AprP is the most efficient protease among previously described alkaline proteases. Furthermore, the AprP was more active toward azocasein than Savinase 4.0 T (Novo) in the presence of 0.1 % surfactants. In the cleaning activity for polluted clothes, AprP and Savinase 4.0 T showed almost equal activity at 25℃. And, the specific activity of AprP was about 2-fold higher than that of Savinase 6.0 T (Novo). The AprP studied in this work, therefore, can be an alternative to the existing proteases.
An additional gene, limK, located immediately downstream of the lipase structural gene, lipK, of Pseudomonas sp. KFCC 10818, was cloned and sequenced and its function was studied. The limK gene could encode a polypeptide, LimK (lipase modulator), of 279 amino acids. When compared to the known modulator proteins, the LimK showed low sequence identities (17.1 - 19.9 %). The lipK gene could encode an active lipase LipK only in the presence of the limK gene. The limK gene exerted its positive effect on the lipase expression in either cis or trans. The trans acting effect indicated that the limK gene actually encoded a diffusible protein product. The inactive lipase was somewhat activated in vitro by the addition of the crude extract of E. coli cells carrying pACTM12 (limK). The activation effect and the result of overexpression experiment of the lipK gene suggested that the limK gene was required for neither the transcription of the lipK gene nor the translation of the lipK mRNA, but the LimK was involved in the lipase folding as a molecular chaperone and the lipase and the modulator protein interact with each other. The P119Q mutant of LipK could be produced as an active enzyme without help of the modulator protein LimK. Therefore, it can be thought that the region containing Pro-119 is involved in the key step (maybe rate-limiting step) in the folding pathway of the lipase and/or interact with a specific region of LimK. On the other hand, the putative mature lipase was overproduced as a MBP-lipase fusion protein and partially purified. SDS-PAGE detected a lipase band of 30 - 31 kDa and an unknown band of 25 kDa. The LipK had its optimum pH at 9 toward p-nitrophenyl palmitate and was stable in the pH range of 6 to 11. The activity of LipK was maximal at 50℃. In the presence of 2 mM $Ca^{2+}$, about 76 % and 36 % of the initial activity remained after incubation for 10 minutes at 65℃ and 75℃, respectively. The lipase showed preference to p-nitrophenyl myristate (an ester of C14 acyl group) among p-nitrophenyl esters with various chain lengths. The activity of the lipase was sensitive to the addition of various metal ions. While $Ba^{2+}, Ca^{2+}$, and $Mn^{2+}$ increased the lipase activity above 2-fold, $Al^{2+}$ and $Fe^{2+}$ significantly reduced the activity of the protein.
Pseudomonas sp. KFCC 10818의 분비되는 염기성 단백질분해효소를 code 하는 유전자인 aprP 를 대장균에서 발현시키고, 발현된 단백질분해효소(AprP)를 순수정제하였다. 이 효소의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 29 kDa으로 결정되었다. 이 process 되어 분비된 AprP의 N-말단 잔기는 alanine 140 번으로 밝혀졌다. AprP는 pH 11에서 최적활성을 나타냈는데, 이 pH는 알려진 subtilisin들의 최적활성 pH 보다 0.5-2 단위가 높은 것이었다. 이 효소는 pH 6-11에서 안정하였다. 2 mM $Ca^{2+}$의 존재하에서, AprP의 안정성은 53℃까지 유지되었다. 최적온도는 60℃ 였는데, 2 mM $Ca^{2+}$가 존재하면 70℃ 이상의 온도에서 최고의 활성을 보였다. 낮은 온도(15℃)에서도 최고활성의 50% 이상에 해당하는 활성을 나타내었다. 이와같은 호염기성과 낮은 온도에서의 높은 활성을 고려할 때, AprP는 효소세제에 쓰이기에 좋은 특성을 갖고 있다. 또한, AprP의 Suc-AAPF-pNA에 대한 $k_{cat}/K_m$ 값은 $9.2 \times 10^3 S^{-1}mM^{-1}$ 이었는데, 이것은 subtilisin 들보다 40 - 1400 배 높은 수치이다. 그러므로, AprP는 지금까지 보고된 단백질분해효소 중에서 가장 효율적인 효소라고 할 수 있다. 게다가, AprP는, 0.1% surfactants 존재하에서 azocasein대해, Savinase 4.0 T (Novo) 보다 더 높은 활성을 나타냈으며, 오염포 세척실험(25℃)에서도 거의 대등한 활성을 보였다. 그리고, AprP의 역가는 Savinase 6.0 T (Novo) 보다 약 두배 높았다. 그러므로, 본 논문에서 연구된 AprP는 현재 사용되고 있는 단백질분해효소들을 대체할 수 있을만한 우수한 효소이다.
Pseudomonas sp. KFCC 10818 의 지질분해효소 유전자(lipK)의 바로 뒤에 위치하는 부가적인 유전자(limK)를 클로닝하여 염기서열을 결정하고, 그 기능을 연구하였다. limK 유전자는 279 개의 아미노산으로 구성된 지질분해효소 modulator 단백질(LimK)를 code 할 수 있었다. LimK는 알려진 modulator 단백질들과 낮은 아미노산 서열 동일성(17.1 - 19.9%)을 보였다. lipK 유전자는 limK 유전자의 존재하에서만 활성있는 지질분해효소(LipK)를 code 있었다. 이러한 limK 유전자의, 지질분해효소 발현에 대한 positive 효과는 cis와 trans 둘다의 조건에서 발휘될 수 있었다. 이 trans acting 효과는, limK 유전자가 실제로 확산되는 (diffusible) 단백질 산물을 code 함을 나타낸다. 불활성의 지질분해효소는 in vitro 에서, pACTM12 (limK) 플라스미드를 갖는 대장균의 crude extract의 첨가에 의해 약간 활성화되었다. 이러한 활성화 효과와 lipK 유전자의 과발현실험의 결과는 limK 유전자가 lipK 유전자의 전사나 lipK mRNA의 번역에 필요한 것이 아니라, LimK가 molecular chaperone으로서 지질분해효소의 folding에 관여하며 지질분해효소와 modulator 단백질이 상호작용한다는 것을 제안한다. LipK의 119 번째 잔기인 proline이 glutamine으로 바뀐 돌연변이는, LimK의 도움이 없어도 활성있는 효소로 만들어졌다. 그러므로, 이 proline을 포함하는 부위가, 지질분해효소의 folding 과정에 있어서 중요한 단계 (아마도, 속도-결정 단계)에 관계하며/하거나 LimK의 특정부위와 상호작용하는 부위라고 추측할 수 있다. 한편, 추정의 성숙 지질분해효소(putative mature lipase)를 MBP-지질분해효소 융합 단백질로써 대량생산하여 부분적으로 정제하였다. SDS-PAGE에서 30-31 kDa의 지질분해효소와 오염되어 따라온 25 kDa 의 단백질 띠를 볼 수 있었다. LipK는 p-nitrophenyl palmitate에 대해 pH 9 에서 최적활성을 나타냈으며, 6 부터 11 사이의 pH 범위에서 안정하였다. LipK 의 최적온도는 50℃ 였다. 2 mM $Ca^{2+}$ 존재하에서, 65℃와 75℃에서 10 분간 두었을 때 각각 초기활성의 약 76%와 36%가 유지되었다. LipK 는 다양한 사슬길이를 갖는 p-nitrophenyl ester 중에서 탄소 14 개짜리 acyl 기의 ester 인 p-nitrophenyl myristate를 선호하였다. LipK 의 활성은 다양한 금속이온들에 대해 민감하였다. $Ba^{2+}, Ca^{2+}$, 그리고 $Mn^{2+}$은 지질분해효소 활성을 두배이상 높이는 반면, $Al^{2+}$과 $Fe^{2+}$는 지질분해효소를 심하게 억제하였다.
