The 6-hydroxymethylbenzo[a]pyrene (HMBP) is converted to electrophilically reactive HMBP 6-sulfate (SMBP) in the presence of 3'-phosphoadenosine-5' -phosphosulfate (PAPS) by sulfotransferase in rat liver. Both HMBP and SMBP were equally strong mutagenic in S. typhimurium strains TA98 and TA100. SMBP also appeared to be mutagenic and cytotoxic in Chinese hamster V79 cells where mutation rate at theNa/K-ATPase and hypoxanthine:guanine phophoribosyltransferase (HGPRT) loci were measured by the resistance to ouabain and 6-thioguanine (6-TG), respectively. Mutation frequencies induced by HMBP and its sulfate derivative at the HGPRT locus were higher than at the Na/K-ATPase locus. The electrophilic sulfuric ester form produced adducts in macromolecules such as DNA and protein in V79 cells, suggesting that mutagenic activity of SMBP derives from the formation of macromolecular adducts, especially DNA adducts. The peak maxima of the fluorescence emission spectra of B[a]P-chromophore was shifted to the longer wavelength regions as DNA was incubated with SMBP, indicating that the highly covalent binding of SMBP with DNA bases may be assumed to be attributable to the intercalation of strongly anionic molecules into the DNA base pairs. This assumption was supported by the results from equilibrium dialysis. Noncovalent interaction between B[a]P moiety and DNA may provide a favorable condition for adduct formation. It was also found that the binding of SMBP to calf thymus DNA was much more efficient than the binding of HMBP in metabolic activation. SMBP binding to DNA was also confirmed by the analysis of electrophoregram of SMBP-modified plasmid.
Chlorophyllin (CHL), a water soluble salt of chlorophyll a, has been known to inhibit mutations induced by several chemical carcinogens. The chemopreventive activity of CHL was measured against HMBP and SMBP in microbial and mammalian cell systems. CHL was quite effective in reducing both cytotoxicity and mutagenicity of SMBP in dose-dependent manner in V79 cells. The inhibitory effect of CHL on SMBP-induced mutation was also confirmed in S. typhimurium strains TA98 and TA100 in which mutation frequency caused by SMBP was diminished almost to control level at a 50 nmol CHL. A similar but less antimutagenic effect of CHL against HMBP was indicated in the V79 assay and the Ames assays. The inhibitory effect of CHL against assault of SMBP in cultured V79 cell was found to be derived from reduced intracellular accumulation of SMBP, leading to a low levels of DNA adduct formation. Inhibitory activity of CHL on the binding of SMBP to DNA was measured by using calf thymus DNA and plasmid as trapping agents. Molecular complex formation between SMBP or HMBP and CHL could be a major factor in decreasing the cytotoxic effect of SMBP, as judged from HPLC analysis of SMBP hydrolysates and partitioning degree of SMBP hydrolysates into different phase. In general, the inhibitions of porphyrins for SMBP was which may be due to the higher concentration of proteins surrounding HMBP. Phthalocyanine, irrespective of coordinated metal, showed highly antimutagenic activity on both HMBP and SMBP. Antimutagenic activity of porphyrins on SMBP in Ames assay did not correlate with that in V79 assay. Among the compound tested here, hemin had the strong inhibitory effects against mutation frequency induced by SMBP on V79 cells, but not so on microbial system. Bacterial cells differ from mammalian cells with respect to their permeability, metabolism and chromosomal organization, and thus their antimutagenic responses may be expected to be different from those of mammalian cells. Vitamin C has been well known to be a potential chemopreventive agent for several toxic compounds. It reduced the mutation frequency of HMBP or SMBP in S. typhimurium TA98 and TA100, indicating that ascorbic acid affects both frameshift and base-pair substitution mutations. The similar type of dose-response relationship was indicated in the V79 assay, although to weaker extent. However, HMBP or SMBP binding to calf thymus DNA was not affected by treatment of vitamin C, suggesting that SMBP seems to be much more reactive to calf thymus DNA than vitamin C. This was also supported by migration pattern and fluorescence intensity of SMBP-modified plasmid on agarose gel. These results were not closely correlated with mutation test in microbial and mammalian cell systems. It has already been reported that vitamin C inactivates SMBP through the formation of covalently bound adduct. It was found from HPLC analysis that the reaction of vitamin C and SMBP was accomplished within just 5 min to produce the several products. These findings indicate that the beneficiary of vitamin C is not merely derived from the covalent adduct. On the other hand, the addition of DNA to incubation mixture reduced the amounts of vitamin C adduct while the magnitude of HMBP increased, suggesting that DNA accelerates the SMBP hydrolysis to intercept the interaction between SMBP and vitamin C, or forms rapidly complex with SMBP.
Serum and bovine serum albumin (BSA) attenuated significantly the cytotoxicity and mutagenicity of SMBP in S. typhimurium TA98 and V79 cells irrespective of failure in reducing SMBP binding to c alf thymus DNA. The inhibitory activity of serum against SMBP-induced cytotoxicity and mutagenicity on Chinese hamster V79 cells may be caused by reduced macromolecular adducts such as DNA and proteins. Serum proteins could act not only as nucleophiles capable of binding covalently with reactive chemicals but also as good ligandin which results in enhancing the lifetime of water-labile chemicals. Albumin, abundant in the plasma, could completely substitute for serum with respect to aforementioned functions. The structural maintenance of BSA seemed to be very determinant factor in extending half-life of SMBP in aqueous environment. Native BSA retained the integrity of SMBP much longer than chemical- or temperature-modified BSA. Presence and micro environment of binding site of albumun for SMBP are considered to be essential to guarantee albumin-associated sequestration of SMBP. Noncovalent binding between BSA and HMBP was identified by the fluorescent spectrophotometry and equilibrium dialysis. BSA-associated HMBP was displaced readily with phenylbutazone (PBZ) which has been well known to a IIA site-specific nonfluorescent ligand in human serum albumin, whereas HMBP bound to chemical-modified BSA was little replaced. Our results implied that covalent modification and sequestration can be responsible for alleviating cellular damage caused by SMBP on V79 cells. It is suggested that the formation of noncovalent complexes with albumin carrying hydrophobic interiors can not only lengthen the lifetime of SMBP but also transport from the site of synthesis to other target macromolecules within the cell. Lipoproteins (LPs), a class of plasma proteins, also sequestered the SMBP in aqueous media to retard its hydrolysis. Residual SMBP in LPs-preincubated mixture was determined using DNA or tetra-n-butylammonium bromide as trapping agent of labile electrophiles. LPs-associated SMBP wa rapidly transferred from LPs to calf thymus DNA. Adduct-forming capacity of LPs-associated SMBP was dependent on preincubation temperature and time. However, heat-treatment of LPs had no effect on SMBP sequestration, suggesting that sequestration capacity is caused by nonspecific solubilization of SMBP within the lipid moiety of LPs, rather than a specific binding to the apolipoproteins.
반응성이 적은 6-hydroxymethylbenzo(a)pyrene (HMBP) 은 3'-phosphoadenosine -5'-phosphosulfate (PAPS) 의 존재하에서 쥐 간에서 얻은 sulfotransferase 에 의해 반응성이 큰 HMBP 6-sulfate (SMBP) 로 된다. HMBP 나 SMBP 모두 S. typhimurium TA98 과 TA100 에 상당한 돌연변이원으로서 작용했다. 즉 TA98 에서의 돌연변이는 0.2 에서 1 nmol 에 이르는 SMBP 의양에 비례하나 TA100 에서는 0.6 nmol 이 넘는 농도에서는 감소했다. 또한 SMBP 는 Chinese hamster V79 세포에서 상당한 돌연변이와 세포독성을 나타냈다. 2.5μM SMBP의 처리는 60% 의 세포를 사멸시켰고 이와 더불어 HGPRT 와 Na/K-ATPase 유전자에서 각각 573 와 204 개의 돌연변이를 유발했다. 일반적으로 HGPRT 유전자에서의 돌연변이는 Na/K-ATPase 에서보다도 높았다. 친전자성 황산 ester 화합물은 세포막을 통과하고 세포내 DNA 또는 단백질과 adduct 를 형성했다. 이는 SMBP 에의한 돌연변이는 adduct 에 의한것임을 암시한다. 한편 SMBP 는 HMBP 보다 훨씬 높은 비율로 calf thymus DNA 와 반응했고 이것은 또한 SMBP 로 처리된 plasmid 의 전기영동 실험에서도 증명되었다. DNA 를 SMBP 와 반응시켰을때 BP-chromophore 의 emission spectra 의 maximum peak 는 장파장으로 이동했다. 이는 이러한 반응이 SMBP가 DNA 염기에 intercalate 하는것과 연관이 있음을 암시한다. 이러한 가정은 equilibrium dialysis 에 의해서 증명이 되었다. 따라서 SMBP 와 DNA 사이의 noncovalent 반응이 adduct 형성에 유리한 조건을 만족해줄수 있을지도 모른다.
Chlorophyll a 와 유사한 구조를 가지며 수용성인 chlorophyllin (CHL) 은 여러 발암물질이 유발하는 돌연변이를 억제 하는것으로 알려져왔다. 본 실험에서는 CHL 의 항돌연변이효과를 SMBP 및 HMBP 를 가지고 각각 V79 세포와 미생물에 대해서 관찰했다. CHL 은 V79 세포에서 12.5μM 까지 SMBP 의 세포독성 및 돌연변이를 감소시키는데 매우 효과적이었다. SMBP 에 대한 CHL 의 억제효과는 Stranins TA98 and TA100 에서도 잘 나타났다. SMBP 에의해서 유발된 돌연변이는 50 nmol 의 CHL 에서 거의 대조군 수준까지 감소되었다. 또한 HMBP 의경우 비슷하지만 덜 효과적인 항돌연변이 효과가 V79 및 미생물계에서 보여주었다. SMBP 에 대한 CHL 의 억제 효과는 SMBP 의 세포내 흡수의 감소, 그것에 따른 DNA adduct 의 감소에 기인되었다. 또한 SMBP의 DNA결합에 미치는 CHL 의 영향은 calf thymus DNA 와 plasmid 를 이용 관찰했다. CHL 존재하에서 SMBP 가수분해물의 HPLC 분석과 SMBP 가수분해물의 분배 정도로부터 분자적 수준에서의 CHL 과 SMBP 간의 상호작용이 중요할 수 있음을 알수있다. 일반적으로 TA98 균주에서 포르피린유도체의 돌연변이 억제 효과는 HMBP 보다 SMBP 에대해서 좋은 것으로 나타났다. 이는 아마도 HMBP activation system 의 많은 단백질 때문일수도 있다. 또한 프탈로시아닌은 배위결합된 금속에 상관없이 HMBP 와 SMBP 에 대해 높은 항돌연변이 활성을 보여주었다. Ames 에서의 porphyrin 의 항돌연변이 활성은 V79 세포에서의 결과와 일치하지 않았다. 즉 hemin 은 포유동물세포에서는 상당히 효과가 좋으나 미생물계에서는 그렇지 모했다. 미생물에서는 포유동물세포와 SMBP 투과성, 대사 및 염색체 구조가 다르기 때문에 항돌연변이정도가 다름을 기대할수 있다. Vitamin C 는 여러 독성물질에대해 화학예방효과가 높은것으로 잘 알려져 왔다. Vitamin C 는 S. typhimurium TA98 and TA100 에서 HMBP 와 SMBP 의 돌연변이율을 억제 했다. 이는 vitamin C 가 frameshift 와 base-pair substitution 의 돌연변이에 각각 영향을 미칠수 있음을 알수 있다. 비슷한 효과가 정도는 약하지만 V79 세포에서도 관찰되었다. 그럼에도 불구하고 vitamin C 는 SMBP 나 HMBP 의 calf thymus DNA 결합을 억제하지 못했다. 이것은 또한 SMBP 로 처리된 plasmid 의 agarose gel 에서 이동과 형광정도에 의해서도 알수 있었다. 이미 vitamin C 는 SMBP 와 공유결합을 통해서 불활성시키는 것으로 보고되어 왔다. 본연구의 HPLC 분석에 따르면 vitamin C 와 SMBP 의 반응은 5 분안에 모두 일어나며 여러가지의 산물을 생성했다. 이러한 발견은 vitamin C 의 세포내에서 작용은 반드시 SMBP 와의 공유결합을 통해서만 이루어지는 것이 아니라는 것을 보여준다. 한편 반응물에 DNA 의 첨가는 vitamin C adduct 를 감소시켰지만 HMBP 는 오히려 증가되었다. 이는 DNA 가 SMBP 의 가수분해를 촉진시켜 SMBP 와 vitamin C 의 반응을 방해한다거나 또는 DNA 가 SMBP 와 직접 빠르게 반응할수 있음을 암시한다.
Serum 과 bovine serum albumin (BSA) 은 SMBP 의 calf thymus DNA 에 대한 반응성에 영향을 미치지 못함에도 불구하고 미생물이나 V79 에서 SMBP 의 돌연변이를 감소시켰다. Serum 의 SMBP 의한 세포독성이나 돌연변이에 대한 억제 효과는 감소된 고분자 즉 DNA 또는 단백질등의 adduct 때문일 수도 있다. 혈청 단백질들은 반응성이 큰 화합물과 직접반응 할 수도 있고 ligandin으로도 작용해서 물에 불안정한 물질의 반감기를 줄일수 있다. 특히 혈액내에 많이 존재하는 albumin 은 앞서 언급한 기능과 관련해서 serum 을 대체할 수 있다. albumin 의 구조를 유지하는것이 수용액계에서 SMBP의 반감기를 줄이는데 결정적인 역할을 하는 것이라 생각된다. 즉 온전한 albumin 이 화학적 또는 온도에 의해 처리된 albumin 보다 더 SMBP 의 integrity 를 오래 유지한다. Albumin 에서의 SMBP 와 결합할수 있는 장소의 존재와 주위 환경이 albumin 과 연관된 SMBP 의 안정화에 기여하리라고 생각된다. Noncovalent 결합은 fluorescent spectrophotometry and equilibrium dialysis 에 의해 확인되었다. BSA 에 결합된 HMBP 는 human serum albumin 의 IIA 에 특이적으로 결합하는 phenylbutazone (PBZ) 에 의해 치환되나 chemical 로 변형된 albumin 은 그렇지 못했다. 따라서 우리의 결과는 albumin 의 공유결합과 안정화 효과는 V79 세포에서 SMBP 에 의한 세포손상을 약화시키는데 중요할 것이라는 것을 암시한다. 소수성인 내부를 가지는 albumin 과의 noncovalent 결합은 SMBP의 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 세포내에서 고분자까지로 이동시킬 수 있으리라고 제안된다. 또한 혈청 단밸질중 하나인 lipoproteins 은 SMBP 를 보호해서 그것의 가수분해를 지연시켰다. Lipoproteins 로 미리 반응시킨 용액에서 남아있는 SMBP는 trapping agent 로서 DNA 또는 tetra-n-butylammonium bromide (TBA) 를 이용 결정되었다. Lipoproteins 와 결합된 SMBP 의 adduct 형성 활성은 preincubation 온도 와 시간에 의존했다. 그러나 열처리한 lipoproteins 은 SMBP 를 보호하는 성질에 있어서 아무 영향을 받지 않았다. 이러한 보호 효과는 SMBP 가 lipoproteins 의 protein 부분에 특이적으로 결합한다기 보다는 lipid 부분의 비특이적인 결합에 있음을 나타낸다.
