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Secretion of heterologous protein in yeast using glucoamylase signal sequence of saccharomyces diastaticus = Saccharomyces diastaticus의 glucoamylase 분비신호 서열을 이용한 효모에서 이종 단백질의 분비
서명 / 저자 Secretion of heterologous protein in yeast using glucoamylase signal sequence of saccharomyces diastaticus = Saccharomyces diastaticus의 glucoamylase 분비신호 서열을 이용한 효모에서 이종 단백질의 분비 / Dae-Ook Kang.
저자명 Kang, Dae-Ook ; 강대욱
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 1996].
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For the purpose of investigating the potential of the glucoamylase signal sequence to construct a yeast secretion system to secrete useful heterologous proteins, the secretions of Bacillus stearothermophilus α-amylase and human lipocortin-1 have been attempted using glucoamylase signal sequence in yeast Saccharomyces sp. As a preliminary study to optimize the glucoamylase signal sequence for the construction of a secretion vector system, two cloned genes, STA1 and SGA coding for the extracellular glucoamylase and sporulation-specific glucoamylase, respectively, were analyzed by Southern blot and nucleotide sequencing analysis and the role of Thr- and Ser-rich region (TS region) of STA1 in the secretion of endo-1,4-β-D-glucanase (carboxymethyl cellulase or CMCase) from Bacillus subtilis was investigated. According to the results of Southern blot analysis, the promoter and signal sequence of STA1 was very homologous to 1.5-kb BamHI DNA fragment (S2), and TS region and mature enzyme-coding region of STA1 had a high homology to 7.5-kb BamHI fragment (S1) and SGA, respectively. The determination of nucleotide sequences revealed that amino acid sequcnces deduced from nucleotide sequences of SGA were almost the same as those of the mature enzyme-coding region of STA1. The probable cleavage site for signal peptidase was also predicted by calculating S-value for each amino acid residue of N-terminal region, suggesting $Gly^{21}$ was a cleavage site. For the secretion of B. stearothermophilus α-amylase from yeast, a recombinant plasmid pGAT17 was constructed by fusing B. stearothermophilus α-amylase structural gene in frame to the promoter and signal sequence of Saccharomyces diastaticus glucoamylase gene (STA1). The secretion of the heterologous α-amylase from S. diastaticus transformed with pGAT17 was confirmed by the halo formation around colonies on selective starch agar medium. About 80% of the total α-amylase activity was detected in the growth medium. The secreted α-amylase was glycosylated and its molecular weight increased from 61 kDa to 75 kDa. The thermostability of the glycosylated α-amylase was markedly enhanced, compared with that of the non-glycosylated enzyme from E. coli. In the presence of 10 mM $CaCl_2$, the α-amylase from yeast completely retained its initial activity after the incubation at 80℃ for 30 min, whereas the α-amylase from E. coli retained 70%. For the development of the recombinant Saccharomyces cerevisiae which can perform the simultaneous saccharification and ethanol fermentation from starch, the recombinant plasmid YIpSTA and pGAR17 containing the glucoamylase gene(STA1) of S. diastaticus and α-amylase gene of B. stearothermophilus, respectively, were integrated into the chromosomal DNA of S. cerevisiae SC3. The existence of STA1 or α-amylase gene in its host strain was verified by Southern hybridization. Moreover, the resulting recombinant S. cerevisiae GMT1 (YIpSTA), GMT2 (pGAR17) and GMT3 (YIpSTA and pGAR17) stably maintained the integrated genes for a 7-day growth period. The amylolytic activity of S. cerevisiae GMT3 was much higher than those of S. cerevisiae MT1 and GMT2. For the secretion of human lipocortin-1 (LC-1) in yeast, a expression and secretion vector was constructed by using the promoter and signal sequence of glucoamylase gene (STA1) of S. diastaticus. After the cDNA of human LC-1 was ligated with the secretion vector, the resulting hybrid plasmid was transformed into S. diastaticus. When the recombinant S. diastaticus was cultivated in YPD medium, LC-1 was expressed and secreted into the growth medium, yielding LC-1 protein at a concentration of 2.5㎍/㎖.

효모 S. diastaticus의 glucoamylase분비신호 서열이 이종 단백질의 분비를 위한 이용 가능성을 연구하기 위한 일환으로서 진핵세포 유래 단백질 중 사람의 LC-1 및 원핵세포 유래 단백질로서 B. stearothermophilus α-amylase를 대표적으로 선택하여 이들 단백질의 분비를 시도하고 분비된 단백질의 특성을 조사하였다. 우선 예비연구로서 본 연구실에서 cloning 한 STA1과 SGA 유전자를 분석, 비교하고 STA1 내에 존재하는 TS region이 이종 단백질의 분비에 미치는 영향을 검토하기 위해 고초균의 섬유소 분해효소를 생산하는 CMCase 유전자를 선택하여 TS region에 도입한 후 TS region이 제거된 정도가 다른 plasmids를 제작하여 섬유소 분해효소가 분비되는 정도를 조사하였다. 또한, 동시당화 에탄올 발효를 수행할 수 있는 효모를 개발하기 위해 STA1과 α-amylase 유전자를 효모의 삽입 운반체인 YIp5와 ARS를 없앤 YRp17 plasmid에 각각 subcloning한 후 S. cerevisiae SC3의 염색체에 삽입하였다. 이러한 연구를 통해서 얻어진 결과들을 요약하면 다음과 같다. Southern blot을 통해서 STA1의 promoter의 분비신호 서열을 함유하는 부위는 염색체의 다i}AE 부위에 존재하는 1.5-kb BamH I 단편 (S2)과 상동성이 높았으며 TS region은 7.5-kb의 BamH I 단편과 그리고 mature glucoamylase를 coding하는 부위는 SGA 유전자와 높은 상동성을 발견할 수 있었다. 두 유전자의 염기서열을 결정한 결과 유추된 mature 각 효소의 아미노산 서열은 거의 동일하였다. 한편 이론적인 방법을 통한 glucoamylase 분비신호 서열이 절단되는 곳은 21 번째 아미노산인 glycine 이었다. TS region은 고초균의 섬유소 분해효소인 CMCase의 분비에 중요한 역할을 하지 않았다. TS region이 온전한 pYESC24를 함유한 효소세포에서는 섬유소 분해능이 전혀 관찰되지 않았다. 반면에 대부분의 TS region이 제거된 plasmids로 형질전환된 효모세포에서는 세포배양에서도 높은 효소활성이 존재하였으며 pYESC10을 제외하고 전체활성의 80% 이상이 배양액에서 발견되었다. 따라서 TS 부위는 CMCase의 분비에 불필요하며 분비신호 자체로 충분함을 확인하였다. 아미노산 Thr과 Ser이 다량 존재하여 친수성이 높은 TS region이 CMCase의 N-말단 부위에 존재할 경우 이 효소가 효모에서 정확하게 folding이 않되거나 분비과정 중 여러 세포막을 통과하는 것이 어려워질 것으로 추정된다. B. stearothermophilus의 α-amylase 유전자를 STA1 promoter와 GAL7 전사종결보위의 조절하에 발현하고 생성된 효소를 glucoamylase 분비신호 서열로써 세포외로 분비를 시도한 결과 총 활성 (3.33 U/㎖)의 약 80%가 세포배양액중에서 검출되었다. 6일간 배양하면서 세포성장과 α-amylase의 분비를 조사한 결과 α-amylase의 분비는 세포 성장과 관련이 있었으며 배양 후 5일이 경과할 때 분비되는 양이 가장 많았다. 효모에서 발현된 α-amylase는 당쇄가 일어난 관계로 분자량이 60 kDa에서 약 75 kDa으로 증가하였으며 Endo-H 효소로써 당을 제거한 결과 대장균에서 발현된 α-amylase의 분자량과 거의 동일하였다. 또한 효모에서 분비된 α-amylase는 당쇄의 결과로 열안정성이 훨씬 증가하여 10 mM $CaCl_2$가 존재할 경우 80℃에서 30분간 열처리하여도 대부분의 활성을 유지하였다. STA1과 α-amylase 유전자를 S. cerevisiae의 염색체에 삽입하여 세 종류의 재조합 효모, S. cerevisiae GMT1 (STA1), S. cerevisiae GMT2 (α-amylase) 및 S. cerevisiae GMT3 (STA1 and α-amylase)를 각각 얻었으며 Southern hybridization을 통해 도입한 각 유전자의 존재를 확인하였으며 7일간 배양하여도 유전자의 소실없이 100% 안정하게 유지하였다. 배양시간에 따른 각 균주의 전분 분해능을 조사하였다. 이 중 두 효소를 생산하는 S. cerevisiae GMT3의 활성이 가장 우수하였으며 6일간 배양하였을 경우 S. cerevisiae GMT1의glucoamylase 활성의 세배, 그리고 S. cerevisiae GMT2의 α-amylase 활성에 비해 두배 증가하였다. 이것은 동시에 분비된 두 효소가 상호 보완적으로 작용한 결과로 해석된다. 그리고 20%의 가용성 전분을 함유한 에탄올 발효용 배지에서 7일간 배양한 후 잔여 전분양을 분석한 결과 S. cerevisiae GMT1과 S. cerevisiae GMT3에서 각각 45%와 25%의 전분이 배지중에 존재하였다. 이것은 분비되는 두 효소의 debranching 활성이 없기 때문으로 생각된다. Glucoamylase 분비신호를 이용하여 사람의 LC-1 분비를 시도하였다. LC-1은 본래 세포질에 존재하는 단백질인 관계로 α-amylase 분비의 결과와는 다르게 생산되는 총 LC-1의 5% 정도만이 세포외로 분비되었으며 (5㎍/㎖) 당쇄는 일어나지 않았다. 이상의 결과들로부터 glucoamylase의 분비신호 서열이 이종 단백질의 분비에 사용될 수 있을 것으로 생각되며 promoter의 최적화, 단백질공학 기법에 의한 효율이 증진된 분비신호 서열의 탐색 등을 통해 더욱 높은 효율로 이종 단백질을 분비시킬 수 있을 것으로 기대된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 96013
형태사항 xiii, 158 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 강대욱
지도교수의 영문표기 : Si-Myung Byun
공동교수의 영문표기 : Tae-Ick Mheen
지도교수의 한글표기 : 변시명
공동교수의 한글표기 : 민태익
수록 잡지명 : "Secretion of Bacillus α-amylase from Yeast Directed by Glucoamylase I Signal Sequence of Saccharomyces diastaticus". Biochemistry and Molecular Biology International. Academic Press Australia, vol. 39, no.1, pp. 181-190
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 139-150
주제 Signal Sequence
Secretion
Glucoamylase
α-amylase
lipocortin-1
분비신호서열
분비
글루코아밀라제
알파아밀라제
리포코틴-1
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