PHB recovery from Alcaligenes eutrophus and a recombinant Escherichia coli strain harboring the A. eutrophus PHA biosynthesis genes, characterization of cell powders containing PHB and recovered PHB, and a feasibility study for the commercial production of PHB were carried out.
To take advantage of both differential digestion and solvent extraction, a new process for PHB recovery from A. eutrophus was developed using dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform. Using the dispersion, the molecular degradation of PHB by hypochlorite could be significantly reduced, minimizing the problems of conventional PHB extraction methods. Optimization of the dispersion treatment was conducted. The PHB recovery(%) from cell powder was maximized using a 30% hypochlorite concentration, a 90 minute treatment time, and a one to one (v/v) chloroform to aqueous phase ratio. Under this optimum condition, the recovery was approximately 91% and the purity of recovered PHB was greater than 98%. The number average molecular weight, $M_n$, of recovered PHB was about 300,000 and the weight average molecular weight, $M_w$, was about 1,020,000, in comparison to the original $M_n$ of 530,000 and $M_w$ of 1,272,000. The crystallinity of recovered PHB was in the range of 60~65%.
As found in the subsequent studies, there existed an interesting relationship between the morphological state of PHB granules and the molecular degradation by hypochlorite during the recovery process. When PHB was recovered using a sodium hypochlorite solution, the amount of PHB degraded to a lower-molecular-weight compound was significant in the case of A. eutrophus, whereas the amount degraded in the recombinant E. coli strain was relatively negligible. On the contrary, there was no difference between the two microorganisms in the pattern of molecular weight change when PHB was recovered using the dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform. To understand these vindings, purified PHB and lyophilized cells containing PHB were examined by differential scanning calorimetry (DSC), scanning electron microscopy (SEM), thermogravimetric analysis (TGA) and nuclear magnetic resonance (NMR). The DSC analysis of lyophilized whole cells suggested that the PHB granules in the recombinant E. coli had a crystalline morphology, while the major part of PHB in A. eutrophus was in a mobile amorphous state. Based on these findings, the patterns of molecular weight change with increasing hypochlorite concentrations could be understood as follows. PHB in recombinant E. coli was thought to be protected from the hypochlorite digestion by its crystalline morphology. When PHB was recovered by using the dispersion, however, the crystalline morphology could not play the protective role due to the dissolution of PHB by chloroform. Furthermore, the SEM study showed that the granule size of PHB in lyophilized recombinant E. coli was much larger than that of A. eutrophus, which also seemed to be one of the key factors in reducing the molecular degradation of PHB during the recovery processes. PHB preparations extracted from the two microorganisms had identical chemical microstructures.
PHB recovery by digestion of non-PHB cell materials (NPCM) was also carried out. When PHB was recovered with sodium hypochlorite or sodium dodecyl sulfate (SDS), NPCM of the recombinant E. coli seemed to be more easily digested than those of A. eutrophus. Furthermore, viscosity increase caused by the cell lysis during SDS treatment was negligible for the recombinant E. coli, whereas a very viscous suspension was formed for A. eutrophus. These results, together with the finding that PHB in the recombinant E. coli was far less susceptible to the molecular degradation by digestion treatments, suggested that the recombinant E. coli was more beneficial than A. eutrophus in terms of PHB recovery. Compared with SDS treatment, hypochlorite treatment was not effective for high biomass concentrations. Therefore, SDS treatment of the recombinant E. coli was selected and optimized for the development of an easy and efficient PHB recovery process. Under the optimal condition of a biomass concentration of 5% (w/v), a ratio of SDS to biomass of 0.6, a treatment time of 60 minutes, and a treatment temperature of 30℃, a PHB of 95% purity with a molecular weight greater than one million could be obtained with ca. 96% recovery. In addition, PHB recovery directly from the fermentation broth was conducted as a preliminary study for the commercial production of PHB.
Although the recombinant E. coli was found to be more beneficial than A. eutrophus in terms of PHB recovery, A. eutrophus was chosen for the feasibility study, since its culture required a cheaper defined medium and a lower oxygen supply, giving a considerably higher productivity than the recombinant E. coli. Using the dispersion treatment and SDS treatment, 1 Kg of PHB was tentatively recovered from the fermentation broth obtained by a fed-batch culture of A. eutrophus in a 60s L fermentor. PHB of 94~98% purity could be obtained with 80~85% recovery. Putting the experimental results and the information cited in ZENECA's patents together, a conceptual process diagram for mass production of PHB has been presented, in which the expected production cost of PHB was estimated to be ca. $3.92 / Kg.
For time-efficient quantifications of PHB in various samples, a simple and quick thermogravimetric analysis method has been proposed. PHB contents could be estimated from the amount of gravimetric change during the thermal degradation of PHB in the range of 250 to 320℃. Due to the simultaneous thermal degradation of cellular materials, PHB contents were estimated slightly higher than those by the conventional gas chromatographic analysis method. However, the PHB contents could be determined accurately using a linear correlation compensating for such errors.
미생물에 의해 생합성되는 poly(3-hydroxyalkanoate), [PHA]는 기존의 합성고뷴자와 물리, 화학, 기계적특성이 비슷할 뿐만아니라 생분해성, 생체적합성, 압전성, 서방성 등의 우수한 성능과 구조의 다양성이라는 장점을 지니고 있다. 이로인해 각종 포장재와 용기 소재를 비롯하여 의료용 봉합사, 접골이음쇄, 솜 등의 의료용구와 농약 및 식물종자 등의 코팅소재, 압전소자 등으로 폭넓게 활용될 수 있으나 생산단가가 비싸기 때문에 그 사용 범위가 특수목적에만 제한되고 있는 실정이다. 생산단가를 낮추기 위한 접근방법으로는 균주의 개발, 생물반응기 시스템의 최적화, 효율적인 분리정제 기술의 개발 등이 있는데 실제로 분리정제에 드는 비용이 많기 때문에 이에 대한 연구가 중요하다.
본 연구에서는 300여종의 PHA 생산균주 중에서 가장 널리 사용되고 있는 균주인 Alcaligenes eutrophus와 A. eutrophus의 PHA 생합성 유전자가 도입된 재조합 대장균에 의해 생합성된 PHA를 분리정제하는 몇가지 방법에 있어서 PHB의 in vivo 상태에서의 구조와 특성이 분리정제 과정의 분자량감소 및 효율성에 미치는 영향에 대해 알아보고, 이외에도 순도, 처리용량, 정제비용이라는 관점에서 각 방법들의 장단점을 비교분석하여 효과적인 PHB 분리정제방법을 개발하고자 하였다. 그리고 PHB의 상업적 생산을 위한 기초 연구로서 PHB의 응용가능성 및 파일롯 플랜트에서의 PHB 생산, 이를 기초로 한 PHB 생산단가의 추정 등에 대한 연구를 수행하였다.
기존의 클로로포름을 사용하는 용매추출법과 차아염소산 나트륨을 사용하는 세포용해법의 장점을 동시에 이용하기 위하여 클로로포름과 차아염소산나트륨을 섞어 만든 분산을 사용하여 PHB를 정제하였다. 미생물은 친수성이고 PHB는 소수성이기 때문에 수용액 상에서 차아염소산나트륨에 의해 미생물이 파괴된 후 유출된 PHB가 즉시 클로로포름상으로 녹아 들어가게 됨으로써 비교적 쉽게 분자량과 순도가 높은 PHB를 얻을 수 있었다. 최적의 분리정제 조건은 차아염소산나트륨의 농도 30%, 처리시간 90분, 차아염소산나트륨 용액과 클로로포름의 비율 1:1 이었으며, 회수된 PHB는 수평균분자량 30만, 중량 평균분자량 102만, 순도 98% 이상, 결정화도가 65%였다. 클로로포름을 이용한 용매추출을 통해 확인된 원상태의 분자량은 수평균분자량 53만과 중량평균분자량 127만이었다. 차아염소산나트륨은 주로 세포파괴, PHB를 제외한 나머지 부분의 용해, 분자량조절, 클로로포름의 점도를 줄이는 작용을 하는 반면, 클로로포름은 차아염소산나트륨에 의해 PHB 분자량이 감소되는 것을 방지하고 고순도의 PHB 회수가 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
본 연구에 의하면 미생물내에 축적되어진 PHB의 구조적 특성과 분리정제과정에 있어서의 분자량감소 사이에는 상관관계가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 차아염소산 나트륨용액을 사용하여 세포용해에 의한 PHB 분리정제를 할 때, A. eutrophus의 경우에는 PHB의 분자량감소가 심하게 일어났으나 재조합 대장균의 경우에는 약간의 분자량 감소만이 관찰되어졌다. 반면에 위에서 언급한 분산처리법을 사용하여 PHB를 분리정제하였을 때에는 두 균주와 상관없이 분자량 감소 양상이 동일하게 나타났다. 이러한 실험결과를 이해하기 위하여 냉동건조 되어진 PHB가 생합성된 A. eutrophus와 재조합 대장균을 differential scanning calorimeter (DSC), scanning electron microscopy (SEM), thermogravimetric analyzer (TGA), nuclear magnetic resonance (NMR) 등으로 분석하였다. DSC 분석결과에 따르면 A. eutrophus에 의해 생합성된 PHB는 결정화도가 16%인 amorphous 상태인 반면, 재조합 대장균에 의해 생합성된 PHB는 A. eutrophus에 의해 생합성된 후 분리정제를 통해 얻어진 결정형 PHB와 비슷한 약 60%의 결정화도를 지니고있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실로부터 위의 실험결과를 이해할 수 있었다. 재조합 대장균의 경우 PHB가 결정형으로 존재하고 있었기 때문에 A. eutrophus에 비해 차아염소산 나트륨에 의한 분자량감소가 적었던 반면 분산처리에 의한 PHB 분리정제의 경우 클로로포름에 의해 PHB가 용해되기 때문에 두 경우에 관계없이 분자량감소 양상이 동일하게 나타나는 것으로 생각되어졌다. 한편, SEM 관찰에 의하면 재조합 대장균에 의해 생합성된 PHB가 A. eutrophus의 PHB 보다 훨씬 큰 것으로 나타났는데 이러한 사실 또한 재조합 대장균의 차아염소산 나트륨에 대한 안정성의 중요한 요인중에 하나인 것으로 생각되어졌다. NMR 분석을 해본 결과, 두 균주에 의해 생합성된 PHB가 동일한 구조를 지니고 있는 것이 확인되어졌다.
분산처리법의 대안으로서 보다 효과적으로 PHB를 분리정제하기 위하여 차아염소산 나트륨 용액이나 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 사용하는 세포용해에 의한 PHB 분리정제에 대해 연구하였다. 위에서 언급한 재조합 대장균의 세포용해 과정에 있어서의 안정성 외에도 PHB를 제외한 나머지 부분의 세포용해가 재조합 대장균의 경우 보다 효과적으로 일어났다. 뿐만아니라, SDS 처리를 통해 PHB를 분리정제할 때, A. eutrophus의 경우 유출된 핵산으로 인한 점도증가 때문에 반드시 열처리를 해주어야 하는 반면, 재조합 대장균의 경우에 있어서는 상온에서 SDS 처리를 하여도 효과적으로 PHB를 분리정제할 수 있었다. 이러한 결과로부터 PHB의 분리정제라는 관점에서 볼 때, 재조합 대장균이 A. eutrophus에 비해 훨씬 유리하다는 것을 알 수 있었다. 처리농도 5% (w/v), SDS의 처리세포에 대한 비 0.6, 처리시간 60분, 처리온도 30℃의 최적조건에서 백만 이상의 분자량을 갖는 95% (w/w) 순도의 PHB를 96%의 회수율로 분리정제할 수 있었다.
PHB의 상업적 생산을 위한 경제성 평가의 일환으로서 PHB 필림제조 및 다른 고분자와의 블렌딩에 관한 기초적인 응용가능성에 대한 연구와 60 L 발효조에서의 PHB 생산, 그리고 발효액으로 부터 PHB를 직접 분리정제하는 공정에 관한 연구를 수행하였다. 위에서 언급한 바와 같이 재조합 대장균이 A. eutrophus에 비해 분리정제라는 측면에서 유리하지만, A. eutrophus의 고농도 발효를 통하여 최종 세포농도 281 g/L, 최종 PHB 농도 232 g/L, 생산성 3.14 g/Lㆍh를 얻을 수 있었기 때문에 재조합 대장균에 비해 월등히 우수한 A. eutrophus의 발효실험 결과를 토대로 PHB 생산단가를 추정하였다. 발효가 끝난 후, 분산처리와 SDS 처리를 통하여 발효액으로 부터 직접 PHB를 분리정제하였다. 이 경우 94~98%의 순도를 지니는 1 Kg의 PHB를 80~85%의 회수율로 시험생산할 수 있었다. 위에서 기술한 실험결과와 영국의 PHA 생산회사인 ZENECA의 특허를 종합하여 PHB의 생산공정을 구성하였는데 이로부터 PHB의 생산단가가 3.92/Kg 정도 될 것으로 추정하였다.
보다 쉽고 빠르게 다양한 시료의 PHB 함량을 분석하기 위하여 열분해 특성을 이용한 PHB 분석방법을 개발하였다. PHB는 TGA 분석시 250~320℃의 온도 범위에서 열적분해가 일어나게 되는데 이 온도범위에서의 중량감소로 부터 PHB의 함량을 추정할 수 있었다. 그러나, 이 과정에 있어서 세포성분 물질의 열분해도 동시에 일어나기 때문에 기존의 gas chromatography (GC)에 의해 측정된 실제 PHB 함량보다 약간 높은 값들이 측정되어졌다. 이러한 오차들은 TGA 분석에 의한 측정값과 GC 분석에 의한 측정값 사이의 상관관계를 통하여 보정할 수 있었다.
