Monoterpenes have a great potential in many industrial areas including fragrance, alternative fuels, and also therapeutics. However, plant extraction of monoterpenes is possible only at low concentration. In the study described herein, applying systems metabolic engineering strategies, we developed efficient recombinant Escherichia coli producing γ-terpinene, linalool, limonene, and geraniol. By expressing mevalonate pathway, along with selecting geranyl diphosphate synthases and monoterpene synthases from several heterologous hosts, we constructed each monoterpene biosynthetic pathway in E. coli. However, for terpinene synthase (TPS2) which was highly insoluble protein in our strain, expression was remarkably elevated by using fusion proteins. Finally, to increase the precursor pool, flux engineering was conducted in E. coli’s genome. Native zwf was overexpressed to increase cofactor pool, and genomic integration of Bacillus subtilis derived fni was conducted to enhance DXP pathway. Finally, when introducing geraniol biosynthetic pathway, final strain WRNYFZ produced 12.4 mg/L and 90.6 mg/L of geraniol, by shake-flask cultivation and fed-batch fermentation. This achievement is the first report on geraniol biosynthesis using cofactor pool and DXP pathway engineering in genomic DNA of E. coli, having potential for applying to other terpenoids production.
모노테르펜은 향료, 대체 연료, 그리고 제약 분야에도 폭넓게 적용되며 많은 관심이 주목되어 왔다. 하지만, 전통적인 식물에서의 모노테르펜 추출은 낮은 농도에서만 가능하다. 따라서, 우리는시스템 대사 공학 전략을 적용하여 감마-테르피넨, 리날쿨, 리모넨, 제라니올을 생성하는 효율적인 재조합 대장균을 개발하였다. 메발론산 경로를 플라스미드 기반으로 도입하고, 여러 이종 숙주로부터 제라닐 이인산 생성효소 및 모노테르펜 생성효소를 선택함으로써 대장균에서 각각의 모노테르펜 생합성 경로를 구축하였다. 불용성 단백질이었던 테르피넨 생성효소(TPS2)의 경우 융합단백질을 사용하여 발현도가 눈에 띄게 높아졌다. 마지막으로, 보조 인자 풀을 증가시키기 위해 대장균의 게놈상 zwf 유전자를 과발현하였으며, DXP 경로를 강화하기 위해 Bacillus subtilis 유래 dxs와 fni의 게놈 도입을 수행하였다. 그 결과, 최종 균주 WRNYFZ는 플라스크 배양 및 유가식 배양을 통해 각각 12.4 mg/L, 90.6 mg/L의 제라니올을 생성하였다. 이 성과는 대장균의 유전체 DNA에서 보조 인자 풀과 DXP 경로에 대한 대사 공학을 이용한 제라니올 생합성에 대한 첫 성과이며, 다른 테르페노이드 생산에 적용될 가능성이 기대된다.
