The Streptococcus pyogenes CRISPR system is composed of a Cas9 endonuclease (SpCas9) and a single-stranded guide RNA (gRNA) harboring a target-specific sequence. Theoretically, SpCas9 proteins could cleave as many targeted loci as gRNAs bind in a genome. We introduce a PCR-free multiple gRNA cloning system for editing plant genomes (Oh et al., 2020). This method consists of two steps: (1) cloning the annealed products of two single-stranded oligonucleotide fragments harboring a complimentary target-binding sequence on each strand between tRNA and gRNA scaffold sequences in a pGRNA vector; and (2) assembling tRNA-gRNA units from several pGRNA vectors with a plant binary vector containing a SpCas9 expression cassette using the Golden Gate assembly method. We validated the editing efficiency and patterns of the multiplex gRNA expression system in wild tobacco (Nicotiana attenuata) protoplasts and in transformed plants by performing targeted deep sequencing. Two proximal cleavages by SpCas9-gRNA largely increased the editing efficiency and induced large deletions between two cleavage sites. This multiplex gRNA expression system enables high-throughput production of a single binary vector and increases the efficiency of plant genome editing.
To generate gene-edited plants without tissue culture, plant viral vectors have been engineered; these vectors express SpCas9 proteins and/or gRNA in plants. This system is called the virus-induced genome editing (VIGE) system (Oh et al., 2021a). In tobacco rattle virus (TRV)-based VIGE system, subgenomic promoters have been used to express gRNAs. However, the transcription initiation sites of the subgenomic promoters remain elusive. Here, we examined the sequence of gRNAs expressed by subgenomic promoters and found the variable length of overhangs at 5′-end of gRNAs. The overhangs at 5′-end of gRNA decrease the cleavage activity of SpCas9. To overcome this problem, we inserted hammerhead ribozyme between the subgenomic promoter and gRNA and confirmed that gRNAs with a precise 5′-end increase the editing efficacy in Nicotiana attenuata (wild tobacco) which express the SpCas9 under the control of 35S promoter (35S:Cas9). This system will be widely used for editing target genes in plants with high efficiency (Oh et al., 2021b). Although the mutation was observed in the infected leaves (10~44%), no edited seeds were found in the M1 population of TRV-infected 35S:Cas9 plants. To increase the expression of SpCas9 in germ cells, we generated N. attenuata transgenic lines expressing SpCas9 under the control of the RPS5A promoter (pRPS5A:Cas9). The RPS5A promoter-driven SpCas9 successfully produced monoallelic mutations with virus-delivered gRNA in seeds of TRV-infected pRPS5A:Cas9. Targeted mutations are essential to understanding gene function in plants; this editing method can dramatically reduce the time and effort required to generate gene-edited plants.
크리스퍼 시스템은 DNA 절단 효소인 카스 단백질과 카스 단백질을 표적 DNA 에 결합시키는 가이드 RNA로 구성됩니다. 가이드 RNA 의 일부 서열 (19~21 bp)을 바꾸면, 이론적으로 유전체 상에 protospacer adjacent motif (PAM)을 가지는 모든 부위를 크리스퍼 시스템을 이용해 교정할 수 있습니다. 하지만 아직 크리스퍼 시스템을 식물 유전자 편집에 사용하는 데에는 전달 효율과 교정 효율이 낮은 문제점이 있습니다. 이 문제점을 극복하기 위해 여러 개의 가이드 RNA를 PCR 없이 하나의 벡터에 클로닝 할 수 있는 시스템을 개발하고 이 시스템이 유전자 교정 효율을 증가시키는 것을 확인했습니다 (Oh et al., 2020). 이 방법은 두 단계로 구성됩니다: (1) pGRNA 벡터에 표적 DNA와 상보적 결합을 하는 서열을 가지는 가이드 RNA를 클로닝하는 단계와 (2) 골든 게이트 클로닝 방법을 사용하여 카스 단백질을 포함하는 벡터에 여러 개의 pGRNA 벡터로부터 tRNA-가이드 RNA 조각을 조립하는 단계입니다. 다중 가이드 RNA 발현 벡터의 유전자 교정 효율과 패턴을 야생 담배(Nicotiana attenuata) 원형질체 및 형질 전환 식물에서 검증 했습니다. 또한, 두개의 가이드 RNA가 근접한 DNA 서열을 표적 했을 때 교정 효율이 크게 증가하고, 두 절단 부위 사이에 큰 결실을 유도하는 것을 확인했습니다. 결과적으로, 이 다중 가이드 RNA 발현 시스템은 식물 형질 전환용 벡터의 high-throughput 생산을 가능하게 하고 식물의 유전체 교정 효율성을 증가시킬 것입니다.
크리스퍼 시스템은 전례 없는 기술 혁신이지만, 대부분의 종에서 조직배양에 의존하여 유전자 교정 식물 제작을 합니다. 조직배양은 굉장히 많은 노동력, 시간, 그리고 비용이 소요됩니다. 따라서, 조직배양 없이 유전자 편집 식물을 제작하기 위해 다양한 식물 바이러스 벡터가 개발 되고 있습니다. 식물 바이러스 벡터는 식물에서 카스 단백질 또는 가이드 RNA를 발현 및 이동 시키기 위해 사용되는데, 바이러스가 처음 감염된 세포에서 증폭하여 분열조직을 감염시킨다면, 조직배양 없이 표적 유전자가 교정된 개체를 얻을 수 있을 것입니다. 이 시스템을 virus-induced genome editing (VIGE) 이라고 합니다 (Oh et al., 2021a). 담배 딸랑이 바이러스 (Tobacco rattle virus, TRV) 기반의 VIGE 시스템에서는 바이러스의 프로모터를 주로 사용하여 가이드 RNA를 발현시킵니다. 그러나, 바이러스 프로모터의 전사 개시 부위는 아직 알려져 있지 않습니다. 따라서, 먼저 바이러스 프로모터에 의해 발현되는 가이드 RNA의 서열을 조사하여, 가이드 RNA의 5′-말단에 다양한 길이의 오버행이 있는 것을 발견했습니다. 가이드 RNA의 5′-말단의 오버행은 카스 단백질의 핵산 절단 활성을 감소시킬 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 바이러스 프로모터와 가이드 RNA 사이에 해머 헤드 리보자임을 삽입하여, 정확한 5′-end를 가진 가이드 RNA의 발현을 유도했습니다. 또한, 35S 프로모터의 제어 하에 카스 단백질을 발현하는 야생 담배 (35S:Cas9)에서 해머 헤드 리보자임이 유전자 교정 효율을 증가시키는 것을 확인했습니다. 이 시스템은 식물에서 표적 유전자를 높은 효율로 교정하는 데 널리 사용될 것입니다 (Oh et al., 2021b). 하지만, 바이러스에 감염된 35S:Cas9 식물의 다음 세대에서는 유전자가 교정된 식물을 찾지 못했습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 생식 세포에서 Ribosomal protein S 5A (RPS5A) 유전자를 조절하는 프로모터의 제어 하에 카스 단백질을 발현하는 야생 담배 (pRPS5A:Cas9)를 제작 했습니다. pRPS5A:Cas9 식물에 바이러스 벡터를 이용하여 가이드 RNA를 전달 했을 때, 조직배양 없이 다음 세대에서 유전자가 교정된 식물을 얻는데 성공했습니다. 따라서, 우리가 제작한 유전자 교정 시스템은 유전자 교정 식물을 생성하는 데 필요한 시간과 노력을 크게 줄여 유전자 기능 연구에 도움을 줄 것입니다.
