Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a common chronic liver disease that affects about 25% of adults globally, yet there are still no effective pharmacological therapies for NAFLD. There have been numerous efforts to understand the underlying pathophysiological factors for NAFLD, but research to elucidate unknown pathological drivers in NAFLD has been chiefly performed by ex vivo methods. Ex vivo methods from sacrificed animals can provide valuable biological information but have difficulty acquiring dynamic information. To observe the constantly varying pathological features in various stages of NAFLD progression in a complex in vivo hepatic microenvironment, spatiotemporal intravital visualization of dynamic alterations in the hepatic micro-environment in the NAFLD progression is a highly desirable approach. Here, we developed intravital liver imaging techniques to visualize the hepatic microenvironment based on custom-design video-rate laser-scanning confocal and two-photon intravital microscopy and longitudinally visualized the various pathological phenotypes in the NAFLD progression.
We successfully visualized the subcellular-level hallmarks of NAFLD in vivo by utilizing a custom-design video-rate laser-scanning confocal microscopy system. We three-dimensionally visualized and quantitatively analyzed the gradual increase of hepatic lipid droplets (LDs) accumulation and their size with the liver vascu-lature simultaneously during the development of hepatic steatosis in the methionine and choline-deficient (MCD) diet-induced NAFLD mouse model. We identified the distinct spatial distribution of different sized hepatic LDs in vivo according to the location in the NAFLD liver. In addition, we could identify the subcellular-level displacement of nuclei in a single hepatocyte and hepatocyte enlargement due to the formation of macrovesicular LDs in a hepatocyte in vivo.
We achieved an in vivo subcellular-level visualization of hepatocellular steatosis and fibrosis in the liver of streptozotocin (STZ)-treated high-fat diet (HFD)-induced NAFLD with hyperglycemia mouse model using the custom-design intravital two-photon microscopy system. Based on two-photon excitation fluorescence (TPEF) and second harmonic generation (SHG) imaging, the hepatic steatosis, the deposition of collagen fibers in the perisinusoidal region, and advanced severe fibrosis accompanying the fibrous septa were clearly observed and quantified with the three-dimensional manner and subcellular level in vivo. Our result of significantly increased hepatic LD diameter and perisinusoidal collagen deposition by STZ treatment in HFD-fed mice suggests insulin deficiency can be a strong driving factor aggravating NAFLD.
비알콜성 지방간질환은 전 세계적으로 매우 높은 유병률을 가진 만성 간 질환이다. 비알콜성 지방간질환 분야에서 주로 조직병리학적 방법을 이용하여 그 병리학적 기전을 밝히는 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 이러한 분석은 질환이 진행하면서 실시간으로 변화하는 동적정보를 획득하고 분석하는 것은 매우 어렵다. 그러나, 살아있는 동물모델에서 장기적으로 실시간 관찰이 가능한 생체 내 간 영상화는 비알콜성 지방간질환이 진행되는 다양한 단계에서의 역동적으로 변화하는 병리학적 특성들을 관찰하고 이를 동적 분석하는데 매우 유용한 연구방법이 될 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 실시간 영상획득이 가능한 고해상도 레이저 스캐닝 공초점 및 이광자 현미경을 자체적으로 제작하여 살아있는 마우스의 간 내 미세환경의 실시간 영상화에 성공하였다. 실시간 공초점 현미경을 기반으로 비알콜성 지방간질환 마우스 모델에서 질환이 장기화될수록 간 내 지방구의 크기 증가와 함께 축적률이 비례하여 증가하였으며 거대 지방구의 형성은 간세포 핵의 위치변화와 간세포의 모양변화를 야기함을 확인하였다. 또한 실시간 이광자 현미경의 이광자 형광 여기와 이차조화파를 이용하여, 고혈당을 동반한 비알콜성 지방간질환 마우스 모델에서 간 세포 내 지방구 축적과 미세혈관 주변의 다량의 콜라젠 축적에 의한 간 섬유화의 고해상도 영상화에 성공하였으며, 미세혈관 주변의 섬유화는 심각한 미세혈관 구조의 변형을 야기함을 확인하였다. 또한 고혈당을 동반한 비알콜성 지방간은 간 섬유화로의 진행을 가속화하는 하나의 요인이 될 수 있음을 시사하였다.
