PART Ⅰ
Hybridomas with non-growth-associated antibody production are thought to exhibit enhanced specific monoclonal antibody productivity ($q_MAb$) when subjected to hyperosmotic stress. Two hybridoma cell lines exhibiting non-growth-associated antibody production, S3H5/γ2bA2 and DB9G8 hybridomas, are cultivated in a batch mode using hyperosmolar media resulting from sodium chloride addition. Their response to hyperosmotic stress regarding $q_MAb$ is quite different, though they show similar depression of cell growth in hyperosmolar media. The $q_MAb$ of S3H5/γ2bA2 cells in a hyperosmolar medium (396 mOsm/kg, 10% fetal bovine serum (FBS) is enhanced by approximately 180% when compared with that in a standard medium (283 mOsm/kg, 10% FBS), while $q_MAb$ of DB9G8 cells in the same hyperosmolar medium is enhanced by only 10%. Thus, the enhanced $$q_MAb$ ot hybridomas exhibiting non-growth-associated antibody production resulting from hyperosmotic stress is cell line-specific.
PART Ⅱ
To test the feasibility of using hyperosmolar medium for improved antibody production in a long-term, repeated fed-batch culture, the influence of various culture conditions (serum concentration and cultivation method) on the hybridoma cells' response to hyperosmotic stress resulting from sodium chloride addition was first investigated in a batch culture. The degree of cell growth depression resulting from hyperosmotic stress was dependent on serum concentrations and cultivation methods (static and agitated cultures). Depression of cell growth was most significant in agitated cultures with low serum concentration. However, regardless of serum concentrations and cultivation methods used, the hyperosmotic stress significantly increased specific antibody productivity ($q_MAb$). Increasing osmolality from 284 to 396 mOsm/kg enhanced the $q_MAb$ in agitated cultures with 1% serum by approximately 124% while the similar osmotic stress enhanced the $q_MAb$ in static cultures with 10% serum by approximately 153%. Next, to determine whether this enhanced $q_MAb$ resulting from hyperosmotic stress can be maintained after adaptation, long-term, repeated-fed batch cultures with hyperosmolar media were carried out. The cells appeared to adapt to hyperosmotic stress. When a hyperosmolar medium (10% serum, 403 mOsm/kg) was used, the specific growth rate (μ) improved gradually for the first four batches and thereafter, remained constant at 0.040 ± 0.003 (average ±standard deviation) $hr^{-1}$ which is close to the value obtained from a standard medium (10% serum, 284 mOsm/kg) in the batch culture. While the cells were adapting to hyperosmotic stress, the $q_MAb$ was gradually decreased from $0.388 to 0.265 ㎍/10^6$ cells/hr and thereafter, remained almost constant at $0.272 ± 0.014 ㎍/10^6$ cells/hr. However, this reduced $q_MAb$ after adaptation is still approximately 98% higher than the $q_MAb$ obtained from a standard medium in the batch culture. Thus, the maintenance of enhanced $q_MAb$ as well as the improved μ after adaptation indicates the potential of using hyperosmolar medium for improved antibody production in a long-term, repeated batch culture.
Part Ⅲ
To test the feasibility of using hyperosmolar medium resulting from sodium chloride addition for improved MAb production in a perfusion system, calcium alginate-immobilized S3H5/γ2bA2 hybridoma cells were cultivated in a repeated-fed batch mode. The strategy of two-stage culture, which consists of cell growth and MAb production stages, was used. To achieve high cell concentration rapidly in cell growth stage, the immobilized cells were first cultivated using the standard IMDM/10% FBS (285.5 mOsm/kg). After the cell concentration reached over $2×10^6$ cells/ml, the serum concentration of medium was reduced to 1% for economical MAb production in MAb production stage. To determine the effect of hyperosmotic stress on the MAb production by immobilized cells, the osmolalities of IMDM/1% FBS used in MAb production stage were varied in the following three different immobilized cell cultures. For the first immobilized cell culture, which was performed as a control, the standard IMDM/1% FBS (284.9 mOsm/kg) was used. Specific MAb productivity ($q_MAb$) of S3H5/γ2bA2 hybridoma cells was significantly enhanced by immobilization. For the second immobilized cell culture, the immobilized cells were exposed to abrupt hyperosmotic stress (397.8 mOsm/kg) by using the hyperosmolar IMDM/1% FBS. The $q_MAb$ of immobilized cells could be further enhanced by 55% by applying abrupt hyperosmotic stress. Furthermore, this enhancement of $q_MAb$ was not transient. Abrupt increase in osmolality, however, inhibited cell growth, resulting in decreased volumetric MAb productivity ($r_MAb$). For the third immobilized cell culture, the immobilized cells were exposed to gradual hyperosmotic stress. Gradual increase in osmolality allowed further cell growth, while maintaining the enhanced $q_MAb$ of immobilized cells. The $q_MAb$ of immobilized cells at 397.8 mOsm/kg was $0.661 ± 0.019 ㎍/10^6 cells/hr$ which is almost identical to that of immobilized cells exposed to abrupt osmotic stress. Accordingly, the $r_MAb$ was increased by ca. 40% when compared with that in the control immobilized cell culture. This enhancement in $r_MAb$ of immobilized S3H5/γ2bA2 cells by applying gradual osmotic stress suggests the potential of using hyperosmolar medium in other perfusion culture systems for improved MAb production.
Part Ⅰ
Non-growth-associated된 항체생산을 보이는 하이브리도마는 hyperosmotic stress에 노출되면 단일군항체 비생산속도의 증가를 보인다고 생각되었다. Non-growth-associated된 항체생산을 보이는 S3H5/γ2bA2와 DB9G8의 두 하이브리도마 세포주를 염화나트륨이 첨가된 고삼투배지에서 회분식으로 배양하였다. 두 세포주 모두 hyperosmotic stress에 의해 비슷하게 세포성장이 감소하였으나, 단일군항체 비생산속도를 보면 hyperosmotic stress에 대한 두 세포주의 반응은 크게 달랐다. 고삼투배지(396 mOsm/kg, 혈청 10% )에서 S3H5/γ2bA2 세포주의 단일군항체 비생산속도는 표준배지(283 mOsm/kg, 혈청 10% )에서 보다 180% 가량 증가하였다. 반면에 DB9G8 세포주의 단일군항체 비생산속도는 동일한 고삼투배지에서 단지 10% 정도만 증가하였다. 따라서 hyperosmotic stress에 의한 하이브리도마 단일군항체 비생산속도의 증가는 세포주 특이적인 현상이다.
Part Ⅱ 장기간의 반복 유가배양에 고삼투배지를 사용하는 것이 타당한지를 조사하기 위해 먼저 고삼투배지를 사용하여 다양한 배양조건(혈청농도와 배양방법)에서 회분배양을 실시하였다. Hyperosmotic stress에 의해 세포성장이 억제되는 정도는 혈청농도나 배양방법(정치배양, 교반배양)에 영향을 받았다. 혈청농도가 낮은 교반배양에서 hyperosmotic stress에 의한 세포성장의 감소가 가장 두드러지게 나타났다. 그러나 혈청농도나 배양방법에 관계없이 hyperosmotic stress는 단일 군항체 비생산속도($q_MAb$)를 크게 증가시켰다. 배지의 osmolality를 284에서 396 mOsm/kg으로 증가시키면 1% 혈청이 첨가된 교반배양의 경우 단일군항체 비생산속도는 124% 가량 증가한 반면 10% 혈청이 첨가된 정치배양의 경우에는 153% 가량 증가하였다. 다음에 hyperosmotic stress에 의해 증가된 $q_MAb$가 세포가 hyperosmotic stress에 적응된 후에도 지속되는지를 알아보기 위해 고삼투 배지를 이용해 장기간의 반복 유가배양을 실시하였다. 세포가 hyperosmotic stress에 적응하여 처음 4 batch 동안 비성장속도가 증가한 다음 $0.040 ± 0.003 hr^{-1}$ 정도로 유지되었는데 이 값은 표준배지를 사용한 회분배양에서 얻어진 값과 비슷한 값이었다. 단일군항체 비생산속도는 0.388 에서 $0.265 ㎍/10^6 cells/hr$로 감소한 후 $0.272 ± 0.014 ㎍/10^6 cells/hr$ 정도로 유지되었다. 그러나 세포가 적응됨에 따라 감소된 단일군항체 비생산속도는 여전히 표준배지에서 얻어진 값보다 98% 가량 높은 값이다. 따라서 세포가 적응함에 따라 비성장속도가 증가하고 항체 비생산속도가 어느 정도 증가된 체 유지된다는 사실은 장기간의 반복 유가배양에서 항체생산 증진을 위해 고삼투배지 사용의 타당성을 많음을 나타낸다.
Part Ⅲ Perfusion system에 고삼투배지를 사용하는 것이 타당한지 알아보기 위해 calcium alginate에 고정화된 S3H5/γ2bA2 하이브리도마 세포를 repeated-fed batch mode로 배양하였다. 세포성장과 항체생산의 두 단계로 이루어진 배양을 수행했는데, 성장단계에서는 세포성장을 빠르게 하기 위해 10% 의 혈청이 첨가된 정상배지(285.5 mOsm/kg)를 사용하였다. 세포가 $10^6 cells/ml$이 넘으면 항체 생산단계로 넘어가는데, 경제적인 항체생산을 위해 혈청농도를 1% 로 낮추었다. 고정화된 세포에 미치는 배지 osmolality의 영향을 알아보기 위해, 다음의 세가지 다양한 osmolality를 항체생산단계에 적용하였다. 대조구 실험인 첫 번째 고정화 배양에는 정상적인 배지(284.9 mOsm/kg)가 사용되었다. S3H5/γ2bA2 하이브리도마의 단일군항체 비생산속도는 고정화에 의해 크게 증가되었다. 두번째 실험에는 급격한 고삼투압의 stress(397.8 mOsm/kg)를 가했는데, 항체 비생산속도는 더욱 증가하여 대조구보다 55% 가량 높았다. 그러나 급격한 stress에 의해 세포성장이 억제되어 단위부피당 항체 생산성은 오히려 감소하였다. 세 번째 실험에서는 점진적인 고삼투압 stress를 가하였는데, 점진적인 stress하에서는 세포성장도 지속되고 항체 비생산속도도 높게 유지되었다. Osmolality가 397.8 mOsm/kg일 경우 항체 비생산속도는 $0.661 ± 0.019 ㎍/10^6 cells/hr$ 정도인데 이것은 급격한 stress를 가한 경우와 거의 같은 값이다. 따라서 단위부피당 항체생산성을 보면 대조구 고정화 배양보다 40% 가량 증가하였다. 고정화된 S3H5/γ2bA2 하이브리도마에 점진적인 stress를 가할 경우 단위부피당 항체생산성이 증가한다는 사실은 다른 perfusion system에도 고삼투배지를 충분히 적용할 수 있음을 보여준다.
