A new bacterial glutathione S-transferase phnC gene cloned from Pseudomonas sp. DJ77 was expressed in E. coli. The gene product PhnC was purified by glutathione-affinity chromatography. The results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel permeation chromatography suggested that PhnC was a homo-dimeric protein, Mr of which is 42 kDa. The isoelectric point was 5.8 by isoelectric focusing. These Mr and pI values were similar to Mr (43200) and pI (5.5) predicted from DNA sequence of phnC. Furthermore, nine N-terminal amino acid residues determined by amino acid sequencer were the same as those predicted from DNA sequence. PhnC showed glutathione S-transferase activity toward glutathione and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) and the specific activity was 10.6 μ mol/min/mg. The specific activity was higher than that of any other known bacterial glutathione S-transferase. PhnC was stable below 35℃ and between pH 6 and pH 9. The highest activity was shown at pH 8.0. An analysis of circular dichroism spectra of PhnC showed that the portions of α-helix, β-sheet, β-turn and random coil structures in PhnC were 6, 13, 22, 49%, respectively. The portions of secondary structures were somewhat different from those of known bacterial and mammalian glutathione S-transferases. Computer modelling of the inital-rate using nonlinear least-squares regression analysis favored a rapid-equilibrium ordered bi-bi mechanism with CDNB binding first, which was different from the kinetic mechanisms of mammalian GSTs.
Pseudomonas sp. DJ77로부터 클로닝된 phnC 유전자를 가지고 있는 E. coli 에서 새로운 세균성 glutathione S-transferase인 PhnC를 expression시켜 glutathione affinity chromatography를 이용하여 분리하였다. SDS-polyacrylamide gel electropheresis에 의한 분자량은 23 kDa으로 나타났으나 Sephadex G-150 gel permeation chromatography에 의한 분자량은 42 kDa으로 나타나 PhnC는 homo-dimeric 단백질임을 알 수 있었다. PhnC의 pI 값은 5.8이었다. 이 분자량과 pI 값은 DNA 염기서열로부터 추정된 분자량과 pI 값과 일치하였다. 또한 분리한 PhnC의 아미노 말단 아미노산 서열을 amino acid sequencer를 이용하여 분석해본 결과 DNA 염기서열로부터 추정된 서열과 일치되었다. PhnC는 glutathione과 1-chloro-2,4-dinitrobenzene을 기질로 사용할때 specific activity가 10.6 μ mol/min/mg로 가장 큰 활성을 나타냈는데 이 값은 지금까지 알려진 다른 어떤 세균성 glutathione S-transferase보다 높은 활성을 나타내는 것이다. 온도에 의한 효소활성의 영향을 알아본 실험 결과 PhnC는 35℃ 이하에서 안정하게 활성이 유지되었다. 또한 PhnC의 활성은 pH 8에서 가장 높았으며 pH 6 이상에서 수시간 안정하였다. Circular dichroism spectrum의 분석 결과, PhnC의 α-helix, β-sheet, β-turn, random coil 구조의 비율은 각각 6, 13, 22, 49%로 나타났는데 이는 이전에 알려진 다른 세균성 또는 포유동물의 glutathione S-transferas의 단백질 2차 구조의 비율과 약간 다른 것이다. Non-linear least-squares regression 방법을 이용하여 PhnC의 초기반응속도 실험 데이터를 효소반응 속도식에 적용한 컴퓨터 모델링에서는 CDNB 가 먼저 binding하는 rapid equilibrium ordered bi-bi 기작이 가장 적합함을 알 수 있었는데, 이는 지금까지 연구되어진 포유동물의 glutathione S-transferase의 반응 속도론적 기작과 차이를 나타내고 있다.
