In order to identify and characterize functional amino acid residues of the SP6 RNA polymerase, the cloned gene was randomly mutagenized by polymerase chain reaction (PCR) under the conditions of reduced Taq polymerase fidelity (20 mM $MgCl_2$, 1 mM dNTP and pH 8.3 at room temperature). Through the two vector system that permits phenotypic isolation of SP6 RNA polymerase mutants with reduced enzymatic activity, 2 single and 1 multiple mutants were isolated. Then, the properties of mutant polymerases were analyzed for promoter binding activity, solubility, non-specific catalytic activity, ability to produce short and long RNAs, and recognition of T7 termination signal. The characterization of these SP6 RNA polymerase mutants showed the following; (1) Deletion of Asn559 gave rise to significant changes in enzyme properties. Asn559 may be essential for unwinding DNA helix. The Asn residue is highly conserved in phage RNA polymerases and lies near motif A found in many nucleotide polymerases. (2) In L605P, only a small amount was obtained in soluble form. Substitutions of Pro for Leu605 retained normal promoter binding activity but exhibited weak catalytic activity. (3) One multiple mutant retained normal promoter binding activity and weak catalytic activity, implying that Val872, Phe873 or Ala874 are not related to the promoter binding, and some of these residues may play roles for the catalytic activity or melting upon DNA helix.
파아지 SP6 RNA 중합효소의 기능에 중요한 아미노산들을 찾고 관련된 기능을 규명하기 위하여, 이 효소의 유전자를 Taq DNA 중합효소의 충실도가 감소된 조건(20 mM $MgCl_2$, 1 mM dNTP, pH 8.3 실온)에서 중합효소연속반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 무작위적으로 돌연변이를 유도하였다. 활성이 감소된 SP6 RNA 중합효소 돌연변이를 표현형으로 골라낼 수 있는 two-vector system을 개발하여 2개의 단일 돌연변이와 1개의 다중돌연변이를 얻었다. 그런 다음, 돌연변이 RNA 중합효소의 전사촉진제에 대한 결합정도, 용해도, 비특이적 촉매활성, RNA를 만드는 능력, T7 전사종결제의 인지여부등을 조사하였다. 이들 SP6 RNA 중합효소 돌연변이들의 특성을 파악한 결과 아래와 같은 결과들을 보였다: (1) Asn559의 deletion은 효소의 특성에 많은 변화를 야기하였다. Asn559는 DNA helix을 열고 또는 단백질 구조형성에 필수적인 역할을 한다. 이 아미노산은 파아지 RNA 중합효소들에서 매우 잘 보존된 아미노산이고, 많은 핵산 중합효소들에서 발견되는 motif-A에 가까이 위치한다. (2) Leu605이 Pro으로 변한 경우는 용해도가 감소하였다. 이 돌연변이체는 SP6 전사촉진제에 결합하는데는 관여하지 않지만 약한 촉매활성을 나타내었다. (3) 두 개 이상의 아미노산이 치환된 다중 돌연변이체는 정상적인 전사촉진제 결합능력은 가지고 있으나, 약한 촉매활성을 나타내었다. 이것으로 보아 Val872, Phe874, 또는 Ala874 잔기들은 전사 촉진제의 결합에는 관여하지 않지만, 이들 중 몇몇은 촉매활성이나 DNA helix을 여는데 또는 단백질 구조형성에 중요한 역할을 할 것이다.
