For the development of industrial strains, random mutagenesis and selection approaches used traditionally, which might cause unknown genotypic/phenotypic changes and undesired mutations in the cells and difficulties for the reproduction of desired physiologies in the cells. Consequently, rational metabolic engineering has emerged as a standard strategy for strain development over the last couple of decades, which allows purposeful modification of metabolic and cellular characteristics by using recombinant DNA and other molecular biological techniques. However, these approaches also attained to some limitations in order to improve cellular performances dramatically in the extent of strain improvement because the scope of engineering the cell is often local, which manipulate only handful genes encoding enzymes and regulatory proteins, rather than system-wide. As systems biology advances as a new paradigm of research thanks to the development of genome-scale computational tools and high-throughput experimental technologies, metabolic engineering powered by the systems-level and large-scale genome wide analyses and computational tools, termed systems metabolic engineering, is now providing new rational and systematic ways for designing and developing strains having improved performances beyond traditional metabolic engineering. The advent of in silico genome-scale metabolic model has brought about the development of various algorithms to simulate the metabolic status of the cell as a whole. In silico genome-scale metabolic model and its simulation play increasingly important role in providing systematic strategies for metabolic engineering. In this thesis, I developed systems metabolic engineering strategies for the re-design of a cell (i.e., accurately predicting metabolic fluxes in genome-scale simulation, in silico gene deletion strategy, in silico gene amplification strategy, and regulating flux ratios at branch points in metabolic pathway) along with their applications based on genome-scale simulations. Also, I developed genome-scale metabolic model and genetic manipulation methods as metabolic tools for applications of the developed strategies. Chapter 1 is an overview of several in silico algorithms with genome-scale metabolic networks for systems metabolic engineering. Chapter 2 reports a strategy for accurate prediction of metabolic fluxes by combining genome-scale model with systematic and condition-independent constraints (i.e., grouping reaction constraints) that restrict the achievable flux ranges of grouped reactions by genomic context and flux-converging pattern analyses. Chapter 3 reports the development of an in silico object-oriented algorithm (i.e., FSCOF) to identify gene deletion targets efficiently for strain improvement and its applications of homo-organic acid production. Chapter 4 reports the development of in silico gene amplification strategy (i.e., FVSEOF with grouping reaction constraints) by genome-scale simulation. Chapter 5 reports the strategy for the redirection of the metabolic fluxes by regulating the metabolic flux ratio at branch points in metabolic pathway. Chapter 6 describes the reconstruction of genome-scale metabolic networks of industrially important microorganism, Ralstonia eutropha H16 for applications of developed strategies. Finally, Chapter 7 reports the re-design of a cell based on the developed systems metabolic engineering strategies. Appendix A and B describe the development of metabolic tools for applications of the developed strategies, which are genetic manipulation methods using sacB suicide vector and mobile group II intron. Results and methodologies presented in this thesis will facilitate the pipeline for systems metabolic engineering and improve our insights into biological systems.
유용한 물질을 과생산하는 산업 균주를 개발하기 위해서 기존에는 무작위 돌연변이법과 스크리닝법이 주로 사용되었다. 하지만 이러한 방법은 세포 내에서 어떠한 유전적인 형질적인 변화가 일어났는지 알기 어렵고, 의도하지 않은 변이를 일으킬수도 있고, 또한 어떠한 변화가 일어났는지 알기 어렵기 때문에 해당 균주를 재현하는데 어려움이 있다. 따라서 지난 몇 십년간 유전자 재조합 기술을 이용하여 세포 내의 원하는 유전자를 조작하는 대사 공학 (metabolic engineering)이 균주 개량을 위한 표준 방법으로 여겨졌다. 하지만 이 방법은 유전자 조작의 범위가 경험과 직관에 기반한 국지적인 수준에 머물기 때문에 균주의 획기적인 개량에는 한계가 있다. 고처리량 (high-throughput) 기술의 발달과 유전체 (genome), 전사체 (transcriptome), 단백체 (proteome), 대사체 (metabolome), 흐름체 (fluxome) 등과 같은 오믹스 (omics) 데이터가 축적되고, 이들의 체계적인 분석을 위한 컴퓨터 공학, 생물정보학, 시스템 생물학 등이 발달하면서 시스템 대사공학 (systems metabolic engineering)이 새로운 패러다임으로 발달하였다. 시스템 대사공학은 시스템 수준의 분석으로 획기적인 균주 개량을 위한 체계적인 방법을 제시할 수 있다. 게놈 수준의 가상세포 모델 (in silico genome-scale metabolic model)과 그 시뮬레이션은 산재되어 있는 데이터의 통합, 세포의 체계적인 분석, 균주 개량 전략 제시 등 시스템 대사공학에서 매우 중요한 역할을 한다. 이미 여러 균주의 게놈 수준의 가상 세포 모델이 구축되고 있고, 이들의 시뮬레이션을 위한 여러 가지 전략들이 개발되고 있다. 본 학위 연구는 시스템 대사공학에서 중요한 균주 개량을 위한 게놈 수준 시뮬레이션 기반의 전략들을 개발하기 위해 이루어졌다. 제 1 장에서는 게놈 수준 분석의 필요성, 게놈 수준의 가상세포 모델의 시뮬레이션을 위한 기본 구조 및 여러 가지 전략에 대해 알아보았다. 제 2 장에서는 세포의 생리 현상을 정확히 예측하기 위해 게놈 문맥 분석 (genomic context analysis)과 대사 흐름 수렴 패턴 분석 (flux-converging pattern analysis)에 의해 기능적으로 연관된 반응식들을 그룹핑하는 그룹 반응 제한조건 (grouping reaction constraint)을 개발하였다. 제 3 장에서는 특정 유전자에 대한 결실 조작이 전체 대사 흐름에 미치는 영향들을 다양하게 파악하고 원하는 유용물질의 과생산을 위한 유전자 결실 후보군을 선정하기 위해 두 개 이상의 목적함수를 사용하는 다목적함수 선형계획법인인 FSCOF를 개발하였고, homo-organic acid 생산 (원하지 않는 부산물은 생산되지 않고 원하는 유용물질만 생산됨을 의미)에 성공적으로 응용하였다. 제 4 장에서는 유용 물질의 과생산을 유도하는 유전자 증폭 후보군을 선정하는 방법론인 FVSEOF with grouping reaction constraint를 개발하였고, 방향족 유용물질인 shikimic acid와 생분해성 플라스틱인 PHB 생산에 응용하였다. 제 5 장에서는 대사 회로에서 전체 대사 흐름 분배에 중요한 역할을 하는 분지점 (branch point)에 해당되는 유전자의 5’번역이 안되는 부위 (5’ untranslated region)를 재구성하여 해당 반응식의 대사 흐름의 비율을 조절하여 대사 회로의 대사 흐름을 조절하는 전략을 개발하였다. 세포 내의 대사 흐름은 13C를 가지고 있는 동위원소 글루코오스 (13C-labeled glucose)를 이용하는 13C-metabolic flux analysis 방법으로 측정되었다. 제 6 장에서는 개발된 여러 전략들의 응용을 위한 하나의 예로써 산업적으로 유용한 균주인 Ralstonia eutropha H16의 게놈 수준의 가상세포 모델을 구축하였다. 제 7 장에서는 본 학위 연구에서 개발된 여러 전략과 결과들에 대해서 균주 개량을 위한 여러 관점에 따라 정리하였다. 첨부 A와 B에서는 개발된 전략들의 응용을 위한 대사 도구가 될 수 있는 suicide vector 또는 mobile group II intron을 이용한 유전자 조작 방법론들을 개발하였다. 본 학위 연구에서 개발된 전략들과 결과들은 생물 시스템에 대한 우리의 통찰력을 향상시켜줄 수 있고, 균주 개량을 위한 시스템 대사공학의 응용에 대한 지침*지표를 제시해 줄 수 있다.
