Part 1.Sol-narae (Sona) is a Drosophila ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin domains) that promotes Wg signaling by positively regulating secretion of Wg and processing extracellular Wg. A genetic screen for suppressors of Sona-induced lethality identified a suppressor that has a mutation in the Sex-lethal interactor (Sin) gene. Nothing has been known for Sin except its physical interaction with Sex-lethal protein. Drosophila Sin is quite homologous with RPC5, a mammalian RNA polymerase III subunit. I found that Sin mutants show apoptosis and defects in PCP signaling. Similar to Sona, Sin was identified in the exosome fraction and was secreted in wing discs under stress conditions such as gamma-ray irradiation. Human RPC5 was also present in the exosome fraction and its secretion was increased by UV irradiation and heat-shock treatment. Hence, I propose that Sin is involved in cell survival and secrets exosomes to cope against environmental stresses in order to promote cell survival.Part II.Extracellular vesicles play important roles in intercellular communication by delivering RNA, lipid, and proteins to neighboring or distant cells. Identification and classification of extracellular vesicles secreted from diverse cell types are essential for understanding their signaling properties. Here, I identified a new group of small extracellular vesicles that I named minisomes. Minisomes were isolated by a subsequent ultracentrifugation of the supernatant fraction after the conventional exosome sepaation. Electron microscopy and nanoparticle tracking analyses showed that minisomes are smaller than exosomes. Typical exosome markers such as Hsp70, TSG101, and CD63 were found in both exosomes and minisomes. However, CD81 was highly enriched in exosomes but not in minisomes, suggesting that minisomes belong to a distinguished group of extracellular vesicles. Furthermore, chemicals that inhibit major exosome production pathways did not decrease minisome release, indicating that the biogenesis pathways are also distinct. Exosomes and minisomes were found in conditioned media of human cell lines as well as fetal bovine serum. Addition of exosomes and minisomes to serum-free media enhanced exosome production and cell proliferation of tissue culture cells, respectively. Our study for the first time identifies minisomes and their specific cellular functions.
Part 1.초파리의 Sex-lethal interactor (Sin)은 Sex-lethal과 결합한다는 연구 결과 외에는 전혀 연구되지 않은 새로운 단백질이다. Sin은 인간의 RNA polymerase III (Pol III) subuint인 RPC5와 상동으로 매우 큰 유사성을 보인다. 본 연구자는 Sin의 새로운 역할들에 관한 연구들을 진행 하여, Sin이 세포사멸에 관계하고 Wnt signaling에 관여하며, 초파리의 발생과정에서 매우 중요하다는 사실을 밝혀내었다. 또한 초파리 Sin뿐만 아니라 인간의 RPC5를 HEK293 세포에서 발현하여 연구 하였다. 초파리 Sin과 인간의 RPC5는 Pol III 의 주변subunit중의 하나로 tRNA를 전사하는데 필요하다. 흥미롭게도 본 연구자는 Sin과 RPC5는 다른 Pol III subunit들과 달리 엑소좀(exosome)에 존재한다는 사실을 밝혀내었다. 특히, 방사선, 자외선, 고열에 노출되어 세포가 스트레스를 받고 손상을 입었을 때 Sin과 RPC5가 즉각적으로 반응하여 엑소좀을 통해 세포 밖으로 분비된다는 사실을 확인하였다. 초파리 날개의 imaginal disc에서 Sin은 평소에 세포밖에 거의 존재하지 않지만, 다양한 스트레스 조건에서 Sin이 즉각적으로 세포 밖으로 분비되고 세포 손상이 회복이 되었을 경우 다시 Sin의 분비량이 줄어드는 것을 볼 수 있었고, RPC5 또한 인간의 세포에서 같은 현상을 나타내었다. 그러므로 Sin은 다른 Pol III subunit들과 다르게 스트레스 상황에 즉각적으로 엑소좀을 통해 분비되어 손상을 입은 세포들이 세포사멸에 이르지 않고 다시 세포가 살아나는데 중요한 역할을 한다는 것을 제시하였다. Part II.세포 외 소포들은 다른 세포에 RNA, 지질 및 단백질을 전달하며 세포간 신호 전달에 중요한 역할을 한다. 다양한 세포 유형으로부터 분비 된 세포 외 소포의 확인 및 분류는 세포 사이의 신호 전달에 대해 이해하는 데 필수적이다. 본 연구에서 세포 외 소포의 새로운 그룹을 발견하여 이를 미니좀이라고 이름을 지었다. 미니좀은 세포배양액을 원심분리로 엑소좀을 분리한 후 남은 상등액을 더욱 빠른 원심 분리를 통해 얻었고, 전자 현미경 및 나노입자분석기를 이용해 엑소좀보다 작다는 것을 확인하였다. Hsp70, TSG101 및 CD63과 같은 엑소좀 마커는 엑소좀과 미니좀 모두에서 발견되었지만, CD81은 엑소좀에 풍부한 반면 미니좀에서는 존재하지 않았다. 이는 미니좀이 엑소좀과 다른 구분된 세포 외 소포 그룹에 속한다는 것을 암시한다. 또한, 주요 엑소좀의 생산 경로를 억제하는 물질들을 세포배양에 사용한 경우에 미니좀은 영향을 받지 않았는데, 이는 엑소좀과 미니좀이 만들어지는 경로가 다르다는 것을 의미한다. 엑소좀과 미니좀을 첨가 혹은 제거하고, 엑소좀이 제거된 FBS를 이용하여 다양한 방법으로 실험한 결과 엑소좀이 첨가된 배양액에서 세포를 키우면 엑소좀의 형성이 증가되고, 미니좀이 첨가된 배양액에서 세포를 키우면 엑소좀의 형성에는 영향이 없지만 세포 증식을 촉진시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과들에 근거하여, 엑소좀과 미니좀은 서로 다른 경로를 통하여 형성되며 미니좀은 세포 증식을 촉진시키는 역할을 하고, 엑소좀은 엑소좀 형성을 촉진시킨다고 결론내었다.
