Methanotrophs synthesize methanobactin, a secondary metabolite that binds copper with an unprecedentedly high affinity. Such a strategy may provide methanotrophs a ‘copper monopoly’ that can inhibit the activity of copper-containing enzymes of other microbes, e.g., copper-dependent N$_2$O reductases. Here, we show that methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b inhibited N$_2$O reduction in denitrifiers. When Pseudomonas stutzeri DCP-Ps1 was incubated in cocultures with M. trichosporium OB3b or with purified methanobactin from M. trichosporium OB3b, stoichiometric N$_2$O production was observed from NO3- reduction, while no significant N$_2$O accumulation was observed in cocultures with a mutant defective in methanobactin production. In addition, copper uptake by P. stutzeri DCP-Ps1 was inhibited by the presence of purified methanobactin, leading to a significant down-regulation of nosZ transcription. Similar findings were observed with three other denitrifier strains. Furthermore, we investigate that multiple copper sequestration strategies of soil methanotrophs may interfere with Cu uptake of soils’ denitrifier and non-denitrifying N$_2$O reducer communities, and result in enhanced N$_2$O emissions from soil denitrification. Denitrification of soil slurry microcosms prepared with rice paddy soils with varying Cu contents exhibited distinctive N$_2$O production trends when amended with purified methanobactin, indicating that methanobactin affected N$_2$O emission from soils’ complex denitrifying communities. The rice paddy soil slurry microcosms enriched with CH$_4$ enhanced N$_2$O production upon transition to anoxic condition, regardless of methanobactin-producing alphaproteobacterial population, suggesting an additional Cu sequestration mechanism in gammaproteobacterial methanotrophs negatively influencing N$_2$O reduction activity. The multimodal influence of methanotrophs on N$_2$O emissions was further investigated with microcosms amended with varying cell numbers of methanobactin-producing Methylosinus trichosporium OB3b before CH$_4$ enrichment. N$_2$O production was enhanced to a greater extent in the OB3b-dominant enrichments than in the Gammaproteobacteria-dominant enrichments; however, significant N$_2$O production enhancement occurred regardless of methanotroph composition. These observations suggest that involuntary inhibition of N$_2$O reduction is a plausible N$_2$O emission mechanism in subsurface soil environments where methanotrophs and denitrifiers coexist.
메탄산화미생물은 구리가 부족한 환경에서 메타노박틴이라는 구리 킬레이트제를 생성하며, 구리와 높은 결합을 보인다. 따라서, 메탄산화미생물은 아산화질소 환원효소와 같이 구리를 이용하는 효소를 포함한 미생물들의 활성을 저해시킬 수 있다. 본 논문에서는 메탄산화미생물인 Methylosinus trichosporium OB3b에 의해 생성된 메타노박틴이 탈질화균의 환원반응을 저해시켜 아산화질소의 발생 및 축적되는 현상을 규명하였다. 탈질화균인 Pseudomonas stutzeri DCP-Ps1와 Methylosinus trichosporium OB3b의 공배양 또는 정제된 메타노박틴을 추가하였을 때, 질산염이 환원됨에 따라 아산화질소가 축적되는 현상을 확인하였다. 또한, Pseudomonas stutzeri DCP-Ps1에 메타노박틴이 추가되었을 때, nosZ의 전사가 저해되는 현상을 확인하였으며 유사한 현상이 다른 3가지의 순수 탈질화균에서 N$_2$O 환원반응이 저해되고, 이에 따라 N$_2$O 발생량이 증가될 수 있음을 밝혀내었다.또한, 토양 메탄산화미생물이 구리를 흡수함에 따라 토양탈질화균 또는 N$_2$O 환원균 군집이 구리를 흡수하는 현상을 저해하여, 토양 탈질화반응으로부터 N$_2$O 발생량이 증가되었음을 확인하였다. 구리 농도가 다른 논 토양 슬러리 microcosm에서 메타노박틴이 주입됨에 따라 뚜렷하게 N$_2$O 발생량이 증가하였으며, 메타노박틴이 토양 탈질화균의 군집의 N$_2$O 발생량을 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 토양으로부터 메탄산화균을 농화 배양한 샘플에서는, 메타노박틴을 생성해내는데 관여하는 유전체를 포함하고 있지 않은 감마프로테오박테리아 메탄산화미생물이 우점함에도 불구하고, 무산소 조건에서 상당한 양의 N$_2$O 축적이 일어남을 확인하였고, 이러한 현상으로부터 감마프로테오박테리아 메탄산화미생물에서도 특수한 구리 흡수 매커니즘을 통해 N$_2$O 환원을 저해하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 알파프로테오박테리아와 감마프로테오박테리아의 경쟁관계를 확인하기 위하여 토양 샘플에 메타노박틴을 생성하는 Methylosinus trichosporium OB3b를 다양한 농도로 주입하여 농화 배양 시켰을 때, 감마프로테오박테리아와 알파프로테오박테리아가 각각 우점하는 조건에서 모두 N$_2$O 발생량이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 알파프로테오박테리아가 우점하는 조건에서 N$_2$O 발생량이 상대적으로 더 많고, 축적되는 시간이 길게 나타났는데, 알파프로테오박테리아의 N$_2$O 환원 저해현상이 더 뚜렷하게 발생함을 확인하였고, 메탄산화균의 군집에 따라 다양한 구리 흡수 매커니즘을 가지며, 이에 따른 N$_2$O 환원 저해 현상 및 N$_2$O 발생량이 증가되었음을 밝혀내었다.
