Using in situ electrochemical polymerization of monomers that form electrically conducting polymers, one can control the thickness of the polymer film and the amount of enzyme that can be immobilized within the film. First, an investigation of the major parameters that influences the immobilization of glucose oxidase by entrapment in polypyrrole films, prepared by electropolymerization from aqueous solutions containing the enzyme and monomer, was carried out. For the electrochemical variables, which primarily govern mechanically stability of the films, even and adherent films were achieved by polymerization of 0.05 M pyrrole at the potentials ranging from 750 to 850 mV vs. Ag/AgCl. In the other hand, for the other parameters such as enzyme concentration, electrochemical growth of the films was found to be significantly inhibited by the presence of increasing amount of enzyme in the deposition solution. Scanning electron micrographs revealed that the morphology of the film was drastically changed by the enzyme concentration, indicating that much rougher surface of the film was obtained at lower concentration of enzyme. As an ultimate effect of the change in the film property, the permeability of the resulting film was found to decrease with increasing enzyme concentration in the deposition solution. Secondly, the polymerization conditions were examined to maximize the response of the resulting biosensor. It was found that the response was critically dependent on both the enzyme concentration and the film thickness and that there were several suboptimal sets of above parameters, which offer maximum responses. When polymerized at the enzyme concentration of 0.5 mg/ml, the optimum thickness of the film was observed to be 250 mC/㎠. In the other hand, when deposited at 5.0 mg/ml, the optimum thickness was about 10 mC/㎠. Furthermore, the sensitivity of biosensor was enhanced by preparing thicker film at lower enzyme concentration, confirming the dependence of the film permeability on the enzyme concentration. Thirdly, in order to evaluate the individual effects of the immobilized activity of enzyme and the permeability of the film on the response of biosensor, the response characteristics of biosensor were investigated by an approximate analytical treatment. All experimental data were found to be in a good agreement with the theoretical prediction. Moreover, derived apparent glucose diffusion coefficient was proven to be inversely proportional to the enzyme concentration during the deposition. Then, the analytical performance of biosensors that were prepared at each suboptimal condition set was compared in terms of the response sensitivity, interference suppression, response time, operational stability, etc. The biosensor, which consisted of thicker film formed at lower enzyme concentration, displayed superior performance to that of thinner one at higher enzyme concentration. Typically, response time was less than 25 sec with the linear range of response up to 10 mM glucose. In addition, the interfering current from ascorbate could be reduced to 3.4% of that at a bare electrode by virtue of the polymer film: During storage of biosensor at room temperature, the sensitivity in the response remains more than 70% even after 3 weeks. Finally, as an approach to improving the performance against interference, a novel configuration of heterobilayer was developed by overlaying horseradish peroxidase-immobilized film on the top of the underlying glucose oxidase film. In situ enzymatic elimination of interference in the proposed system was demonstrated by examining responses either in the absence or presence of interferants in the sample. For glucose concentration higher than 50 mM, the deviation of detection arising from presence of interferants could be reduced less than 7%.
전기전도성 고분자인 polypyrrole 를 이용하여 포도당 측정용 바이오센서를 제작하였다. 전기화학적 중합법을 통해 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 를 전기전도성 고분자 박막내로 포획하여 고정화 시킬 수 있었다. 전기중합으로 얻어지는 고정화 효소 박막의 전기화학적, 물리적 특성을 조사하였고, 그 결과를 전기중합 도중에 관찰되는 전기화학적 특성과 결부시켜 완성된 바이오센서의 응답특성에 대해 미치는 영향을 조사하였다. 바이오센서의 분석능을 극대화시키기 위하여 전기중합에 관여하는 모든 요인들과 그 상호관계에 대한 체계적인 연구가 이루어졌다.
전기전도성 고분자를 생체물질의 고정화 담체로서 사용함으로써, 백금전극 표면에 효소를 매우 효율적이고 재현성 있게 고정화 시킬수 있었다. 이는 고정화 박막의 전기전도성에 전적으로 기인하는데, 중합용액내 효소농도를 증가시키거나 전기중합으로 자라나는 박막의 두께를 늘려줌으로써, 바이오센서의 감도를 증진시킬 수 있었다. 전기증합은 Ag/AgCl 표준전극 대비 700 mV의 전위차에서 0.05 M pyrrole 의 0.1 M KCl (pH 7.0) 을 바탕용액으로하여 이루어졌다.
바이오센서 응답감도는 고정화된 효소의 양에 크게 의존하는데, 중합용액내의 효소농도를 증가시킴에 따라 polypyrrole 의 형성속도는 오히려 감소되는 현상이 발견되었다. Cyclic voltammetry 분석을 통하여, 그 원인은 polypyrrole 성장 초기의 핵형성과정을 효소 분자가 방해하기 때문인 것으로 판단되었다. 아울러 주사전자현미경을 이용하여 중합용액내 효소농도 변화에 따른 고정화 박막의 표면의 변화를 관찰한 결과, 박막의 물리적 치밀성 은 효소농도 증가에 따라 함께 증가하는 현상이 발견되었다. 이러한 박막의 물리적 특성은 투과도와 직접적으로 관련되는 것이 실험적으로 입증되었다.
전기중합에 관여하는 요인중 pyrrole 농도는 0.05 M 에서 최대의 고정화 활성을 보였다. 고정화 박막의 두께와 중합용액중 효소 농도는 긴밀한 상호 연관성을 보이며, 따라서 감도에 대한 여러 최적 조건들이 존재하는 것으로 관찰되었다. 이들중에서 0.5 mg/ml 의 효소 농도에서 250mC/㎠ 의 두께로 전기중합한 결과 형성된 바이오센서의 분석능력이 가장 우월한 것으로 결론지어졌다. 그 조건에서 바이오센서의 응답시간은 25초 이내로 10 mM 의 포도당의 농도에까지 선형응답하였다. 제작된 바이오센서를 상온에서 3주간보관하면서 응답을 조사한 바, 초기값의 70% 이상의 감도가 유지됨을 알 수 있었다.
고정화 효소 박막에서의 반응을 수학적으로 모사함으로써, 실험 결과와 그에 따른 결론들을 보다 심층적으로 해석할 수 있었다. 이론에 의한 추정치와 실험 결과들는 매우 잘 일치하였으며, 더우기 유도된 박막내에서의 포도당의 확산계수들로부터 앞서 관찰된 중합 조건에 따른 박막의 투과도의 의존성이 다시 검증되었다.
전류법 측정 바이오센서에서 측정에 오차를 유발하는 간섭문제를 개선하기 위해서, 과산화효소 (horseradish peroxidase) 에 의한 전기활성 간섭물질의 생화학적 산화가 가능한 새로운 이중박막형태의 바이오센서를 고안하였다. 주어진 형태의 바이오센서에서 역확산 되는 과산화수소를 이용한 간섭 신호 억제가 이루어짐이 실험적으로 밝혀졌다. 아울러 50 mM 이상의 포도당 측정시, 간섭 물질에 의해 유발되는 오차는 원래 신호의 7% 이내로 매우 낮게 유지될 수 있는 것으로 판단되었다.
