A hydrolytic enzyme xylanase was produced using a genetically modified Bacillus subtilis strain, and its properties were characterized. The strain Bacillus subtilis(pJX18) used was previously constructed in our laboratory. This strain contains a xylanase gene from Clostridium thermocellum artificially connected to a strong native Bacillus promoter. The xylanase hydrolyzes xylan, which is the second abundant organic compound next to cellulose in nature, into xylooligosaccharides. The xylooligosaccharides, especially xylobiose and xylotriose, are industrially attractive, because they are known to stimulate the growth of Bifidobacterium selectively in human and animal intestines and, in turn, suppress the growth of undesirable intestinal flora.
The extracellular xylanase was produced by growing B. subtilis(pJX18) in a 7-liter fermentor at 37℃ and pH 8. The culture medium was composed of maltose(40 g/l), yeast extract(1.5 g/l), $K_2HPO_4$(3.5 g/l), $KH_2PO_4$(1.5 g/l), and trace metal solutions. When the growth approached the stationary phase, the xylanase production started and reached a maximum level of 74.3 U/ml, after 12 hours of cultivation. Under the culture temperature of 37℃ and the pH range of 6 to 9, the plasmid showed a 100% stability.
The xylanase produced was purified by acetone precipitation and column chromatographies on Sepharose 6B and DEAE-Sepharose. SDS-PAGE and isoelectric focusing of purified xylanase were carried out. The molecular weight and pI value of enzyme were determined to be 59 kilodalton and 4.7, respectively.
The xylanase showed a sharp temperature preference at 60℃ for its activity. However, at temperatures above 60℃, this enzyme lost its stability rapidly, while the enzyme was quite stable as far as it was stored at temperatures below 55℃. Under the optimal reaction temperature of 60℃, the enzyme preferred pH 5.4 sharply for its activity. The enzyme was stable in a broad range of pH between 4 and 7. The apparent $K_m$ value of the xylanase was 0.9 mg/ml. and the $V_{max}$ value was 48.9 μmole of xylose/min.
The xylanase hydrolyzed 44% of xylan into xylooligosaccharides in four hours. In the same time, the portions of less-membered oligomers such as xylobiose(X2), and xylotriose(X3) increased and reached 63% and 21%, respectively. The high portions of X2 and X3(84% together) among the hydrolysis products from xylan is encouraging, because these two low-member xylooligomers are mostly preferred in the industrial applications.
유전자 재조합 Bacillus subtilis를 이용하여 가수분해 효소의 일종인 xylanase를 생산하였으며, 그 효소의 특성을 규명하였다. 생산 균주로 사용된 Bacillus subtilis(pJX18)는 본 실험실에서 개발된 것으로, 강력한 Bacillus promoter에 Clostridium thermocellum ATCC 27405의 염색체로 부터 유래한 xylanase 유전자를 인공적으로 결합시킨 플라스미드를 갖고 있다. 본 xylanase는 자연중에 셀룰로오스 다음으로 풍부한 유기물인 xylan을 가수분해하여 xylooligo당을 생산한다. Xylooligo당, 특히 그중의 xylobiose와 xylotriose는 인체와 동물의 장내에서 Bifidobacterium의 선택적인 증식을 촉진하고, 그로 인하여 장내 유해균총을 억제하는 효과가 있으므로 산업적인 관심을 끌고 있다.
B. subtilis(pJX18)을 7-liter 발효조로 37℃ 및 pH 8 에서 배양하여 extracellular xylanase를 생산하였으며, 이때 maltose(40 g/l), yeast extract(1.5 g/l), $K_2HPO_4$(3.5 g/l), $KH_2PO_4$(1.5 g/l) 및 trace metal 용액으로 이루어진 합성배지를 생산배지로 사용하였다. 균체의 성장이 정지기에 도달하였을 때, xylanase의 생산이 개시되어 배양 12 시간에 최고 74.3 U/ml 수준의 xylanase를 생산할 수 있었다. 배양중 플라스미드는 37℃ 이하의 온도와 pH 6 - pH 9의 범위에서 100% 안정하였다.
본 xylanase의 분리정제를 위하여 acetone 침전과 Sepharose 6B 및 DEAE-Sepharose 칼람 크로마토그라피를 행하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE와 isoelectric focusing으로 분석한 결과, 분자량과 pI 값은 각각 59 kilodalton과 4.7로 결정되었다. 본 xylanase는 60℃에서 가장 높은 역가를 보였으며, 60℃ 이상의 온도에서는 안정성이 급격하게 저하되었으나, 55℃이하에서는 상당히 안정하였다. 60℃의 반응조건에서의 최적 pH는 5.4였으며 pH 4 와 7의 넓은 범위에서 안정하였다. 겉보기 $K_m$ 값과 $V_\max$ 값은 각각 0.9 mg/ml과 48.9 μmole of xylose/min 이었다.
Xylanase 는 4시간만에 44% 의 xylan을 xylooligo 당으로 분해하였으며, 같은 시간에 생산된 전체 xylooligo 당 중 xylobiose(X2) 및 xylotriose(X3)등 저당류의 oligomer를 각각 63% 및 21% 생산하였다. 이같이 xylobiose와 xylotriose를 높은 함량(합계 84%)으로 생산할 수 있는 특징은 이 효소가 oligo 당의 산업적 제조에 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 보여준다.
