Although details of the protein folding in vitro were investigated with the recent technical advances, little is known about the folding of protein inside the cell that occurs in a quite different physicochemical environment because of the lack of tools to monitor the folding in vivo. In an attempt to compare protein folding in vitro with the folding in vivo, the protein translocation system of Escherichia coli was employed. According to the kinetic partitioning model of the protein translocation, mutations that affect the in vivo folding of ribose-binding protein (RBP) were isolated by selecting intragenic suppressors for the export-defective signal sequence. Along with 3 suppressor mutations in the signal sequence, eleven different amino acid substitutions were found in the mature region. In the three-dimensional structure of RBP, ten mutational changes were localized in the hydrophobic region of the N-domain in this two-domain protein together with the previously reported two suppressors [Kim et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 5219-5227]. The stability of the purified mutant proteins were decreased by 2.1 to 5.1 kcal/mol as determined by the equilibrium unfolding study with the tyrosine fluorescence in the six mutational changes investigated. Kinetic study for refolding and unfolding induced by guanidine hydrochloride revealed that refolding of mutant proteins was retarded by 4.4 to 63-fold compared to that of wild type while unfolding were little affected. Together with the concentration of the randomly selected folding mutations in the N-domain, this kinetic result suggests that folding events in the N-domain are critical in the rate-limiting step of the refolding of RBP in vitro. By analyzing the unique translocation kinetics of mutant proteins according to the theoretical model that describes translocation kinetics in terms of the rates of export and folding in vivo, the rate coefficients for the folding in vivo were separated and compared with the folding rates in vitro. The linear correlation between the folding rates in vitro and in vivo implies that the protein folding in vivo follows the same rate-limiting step as the folding in vitro and the differences in the activation free energy among mutant proteins in vitro should be conserved in the folding in vivo.
대장균의 단백질 수송과정에서 kinetic partitioning model을 이용하여 세포내에서 단백질 folding과 시험관에서(in vivo) 단백질 folding을 비교 연구하였다. 리보스 결합단백질의 수송을 억제하는 신호배열 돌연변이(rbsB103) 로부터 복귀돌연변이를 선별함으로써 이 단백질의 folding을 억제하는 돌연변이들을 분리하였다. 신호배열에 존재하는 3개의 복귀돌연변이와 함께 숙성체 부위에 11개의 복귀돌연변이가 발견되었는데, 이전에 분리된 2개의 복귀돌연변이를 포함하여 10개의 돌연변이가 3차구조의 N-domain에 집중되어 있었다. 대부분의 돌연변이는 단백질의 folding에 영향을 줄 수 있는 소수성 내부에서 위치하였으며, 6가지 돌연변이 단백질에 대하여 tyrosine 형광을 이용한 equilibrium folding 실험 결과, 6개의 돌연변이들이 2.1 kcal/mol에서 5.1 kcal/mol 까지 이 단백질의 안정성을 감소시켰다. Kinetic folding 실험에 의하여 각 돌연변이 단백질들이 야생형에 비하여 4.4배에서 63 배까지 느리게 refolding되는 것을 관찰하였으며 unfolding 속도에서는 거의 영향을 받지 않음을 알 수 있었다. 이와 같은 folding 실험의 결과는, 무작위로 선택된 돌연변이들이 N-domain의 일부에 집중된다는 사실과 함께 N-domain의 구조 형성이 이 단백질의 folding에서 속도결정단계(rate-limiting step)임을 의미한다. 한편 돌연변이 단백질의 전위 kinetics를 분석하여 각 단백질의 세포내에서 folding 속도에 대한 상수를 분리하고 이들을 정제된 돌연변이 단백질에서 측정된 folding 속도 상수와 비교하였다. 세포내에서 예측되는 단백질의 folding 속도상수가 시험관 내에서 정제된 단백질의 folding에서 측정된 속도상수와 비례하므로, 이로부터 세포내에서 일어나는 단백질 folding과 시험관에서 진행되는 단백질 folding이 동일한 속도결정단계를 거쳐서 진행됨을 알 수 있었다.
