As a development of the central nervous system occurs, dynamically changing cellular microenvironments provide local chemical and physical cues in the form of neighboring cells and extracellular matrices for neurons. Neurons respond to the surrounding information of neuron-material interfaces via changing their morphological features. This dissertation deals with unanticipated effects of designed micro- and nano-topographically modified substrates on primary hippocampal neurons and the potential of topographical structures in recapitulating in-vivo neuronal behaviors at cellular/subcellular level in the in-vitro culture platforms. A historical overview of reports discussing neuronal movements on environmental gradient chemical and physical cues is introduced. Pitch-dependent migration behavior of primary hippocampal neurons and different modes of migration were found with the silicon microcone arrays presenting various pitches in the micrometer range. Physical interactions between nanostructures of nanopillar arrays and hippocampal neurons promoted the developmental processes, such as an axon branching and an axon elongation. Environmental chemical and physical cues dynamically interact with migrating neurons and sprouting axons, and in particular, the gradients of environmental cues are regarded as one of the factors intimately involved in the neuronal movement. The gradients of physical cues, such as stiffness and topography, which also interact constantly with the neurons and their axons as a component of the extracellular environments, have rarely been noted regarding the guidance of neurons, despite their gradually increasingly reported influences in the case of nonneuronal-cell migration. In this chapter, chemical (i.e., chemo- and hapto-) and physical (i.e., duro-) taxis phenomena on the movement of neurons including axonal elongation were discussed. In addition, a topotaxis, the most recently proposed physical-taxis phenomenon, was suggested as another potential mechanism in the neuronal movement, based on the reports of neuronal recognition of and responses to nanotopography. Neuronal migration is a complicated but fundamental process for proper construction and functioning of neural circuits in the brain. Migratory behaviors of primary hippocampal neurons were investigated when neurons were cultured on a silicon microcone (SiMC) array that presents fourteen different pitch domains. Neuronal migration becomes the maximum at the pitch of around 3 μm, with an upper migration threshold of about 4 μm. Immunocytochemical studies indicate that the speed and direction of migration, as well as its probability of occurrence, are correlated with the morphology of the neuron, which is dictated by the pitch and shape of underlying SiMC structures. In addition to the effects on neuronal migration, the real-time imaging of migrating neurons on the topographical substrate reveals new in-vitro modes of neuronal migration, which have not been observed on the conventional flat culture plate, but been suggested by in-vivo studies. Axon collateral branches, as a key structural motif of neurons, allow the neurons to integrate information from highly interconnected, divergent networks by establishing the terminal boutons. Although physical cues are generally known to have a comprehensive range of effects on neuronal development, their involvement in axonal branching remains elusive. Herein, it was demonstrated that nanopillar arrays—at about 400 nm of pitch and 280 nm of height—significantly increase the number of axon collateral branches and also promote their growth. Immunocytochemical studies and biochemical analyses indicate that the physical interactions between the nanopillars and the neurons give rise to lateral filopodia at the axon shaft via cytoskeletal changes, leading to the formation of axonal branches. This work, as the first demonstration that nanotopography regulates axonal branching, provides a guideline for the design of sophisticated neuron-based devices and scaffolds for neuro-engineering.
본 논문의 주제는 마이크로 및 나노미터 크기의 구조체 표면 토포그래피(topography)에 의한 해마신경세포(primary hippocampal neuron)의 형태학적 거동 변화에 대한 연구이다. 발달 과정에서 신경세포는 주변 세포와 세포외기질(extracellular matrix) 등의 형태로 지속적으로 변화하는 국지적인 형태의 화학적, 물리적 신호를 주변의 미소 환경(microenvironment)에서 제공받고, 형태학적 특성을 변화하여 신경세포-물질 계면(neuron-material interfaces)을 통해 전달받은 주변 정보에 반응한다. 세포 주변 환경의 화학적, 물리적 신호는 역동적으로 신경세포의 이동과 축삭 돌기의 돌출 과정에 작용하는데, 특히 이러한 신호들의 gradient는 신경세포의 움직임에 밀접하게 연관이 있는 요소 중 하나로 고려된다. 이 장에서는 화학적 (chemo-, hapto-), 물리적 (duro-) taxis 현상에 의한 신경세포의 움직임을 논의하였다. 여기에 추가적으로 신경세포가 배양 기판 표면의 나노토포그래피(nanotopography)를 인식하고 이에 반응한다는 연구 결과들을 토대로, 다른 세포(nonneuronal-cell)들을 대상으로 제시된 topotaxis 현상이 신경세포의 움직임에도 잠재적으로 작용할 수 있다는 가능성을 제안하였다. 신경세포의 이동은 뇌가 신경회로를 구성하고 회로가 적절하게 기능을 할 수 있도록 유지하기 위해 수반되는 복합적이지만 핵심적인 과정이다. 1934년에 발표된 Weiss의 초기 연구를 시작으로 상당수의 생체 내 신경세포 연구들이 신경세포의 이동과 세포 주변 환경의 물리적 특성의 관련성을 제시하였으나, 생체 외 신경세포 연구에서 배양 기판 표면의 토포그래피와 연관된 신경세포의 이동은 입증된 바가 없다. 이 장에서는 서로 다른 14개의 피치(pitch)로 구성된 실리콘 마이크로콘(silicon microcone) 기판 위에 배양된 신경세포의 이동 경향을 관찰하여, 이동 속도가 약 3 μm의 피치에서 가장 빠르고, 피치가 4 μm보다 큰 경우에는 평균 이동 속도가 급격히 느려진다는 사실을 밝혔다. 또한 기판 표면의 토포그래피에서 이동하는 신경세포에서 기존의 평평한(flat) 생체 외 세포 배양 기판에서는 관찰되지 않았지만, 생체 내 신경세포 연구에서 제시되었던 몇몇 신경세포의 이동 방식(mode)들을 실시간(real-time) 이미징으로 관찰하였다. 축삭돌기가지(axon collateral branch)는 신경세포의 특성을 나타내는 뚜렷한 구조 중 하나로, 종말 팽대(terminal bouton)의 형성을 통해 고도로 연결된 신경망에서 전달되는 정보를 신경세포가 통합할 수 있도록 한다. 이 장에서는 고분자 나노기둥 기판(nanopillar array) 위에서 신경세포를 배양했을 때 형성되는 축삭돌기가지의 수가 크게 증가하고 축삭돌기의 성장이 촉진된다는 사실을 밝혔다. 면역염색법과 억제제(inhibitor)를 통해 나노기둥 구조와 신경세포 사이의 물리적 상호작용으로 인한 세포골격근(cytoskeleton)의 변화가 축삭돌기의 filopodia 생성을 일으키고 그 결과 축삭돌기가지의 형성을 유도한다는 사실을 알 수 있었다. 본 연구는 마이크로 및 나노미터 규모의 표면 토포그래피가 기존의 생체 외 배양 플랫폼에서 보여주지 못했던 신경세포와 하위 구조의 거동을 유도한다는 것을 입증함으로써, 정교한 형태의 신경세포 기반(neuron-based) 구조체 설계 등의 신경공학 분야와 기초연구에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
