Glycans are intimately involved in several facets of neuronal development and neuropathology. However, the roles of glycans remain elusive compared with those of proteins or lipids because of their diverse and dynamic nature. Method for investigating their functions, using a lectin or eliminating glycosyltransferase gene, had been limited. Metabolic labeling strategy developed in 1997, incorporation of unnatural monosaccharides in the biochemical synthesis of glycans as a chemical reporter, is a powerful tool for exploring the functions of cell-surface glycoconjugates, because it can be chemically modified glycans, directly, without usage of protein or gene.In the neuronal development, the posttranslational modification of neural cell-adhesion molecule (NCAM) with polysialic acid (PSA) play an important role by regulating adhesions of NCAM. A tissue-based strategy, incorporation of a chemical reporter metabolized by hippocampal tissues before dissociation into individual cells, were developed for metabolically incorporating an unnatural monosaccharide, peracetylated N-azidoacetyl-D-mannosamine, in the sialic acid biochemical pathway to present N-azidoacetyl sialic acid to PSA-NCAM. Although significant neurotoxicity was observed in the conventional metabolic labeling that used the dissociated neuron cells, neurotoxicity disappeared in this modified strategy, allowing for investigation of the temporal and spatial distributions of PSA in the primary hippocampal neurons. PSA-NCAM was synthesized and recycled continuously during neuronal development, and the two-color labeling showed that newly synthesized PSA-NCAMs were transported and inserted mainly to the growing neurites and not significantly to the cell body. The spatial distribution of cell‐surface glycoconjugates in the brain changes continuously, reflecting neurophysiology especially in the developing phase, but their functions and fates mostly remain unexplored. Their spatiotemporal distribution is particularly important in polarized neuronal cells, such as cerebral cortical neurons composed of a soma and neurites. The multiplexed information on their spatiotemporal distribution on polarized cortical neurons were obtained by dual-labeling sialic acid (Sia5Ac) and N‐acetylgalactosamine/glucosamine (GalNAc/GlcNAc) using a neurocompatible strategy of metabolic glycan labeling, metabolism‐by‐tissues (MbT). The analyses showed the preferentially distinct distribution of each saccharide set at the late developmental stage after randomized, heterogeneous distribution at the early stage, suggesting that Sia5Ac and GalNAc/GlcNAc are translocated anisotropically during neuronal development.Although the tissue-based metabolic labeling strategy was developed, the metabolic labeling of surface glycans in primary neurons is still a difficult task because of the neurotoxicity of unnatural monosaccharides that are used as a metabolic precursor, hindering the progress of metabolic engineering in neuron-related fields. Therefore, we report a neurosupportive, neuron–astrocyte coculture system that neutralizes the neurotoxic effects of unnatural monosaccharides, allowing for the long-term observation and characterization of glycans in primary neurons in vitro. Polysialic acids in neurons are selectively imaged, via the metabolic labeling of sialoglycans with peracetylated N-azidoacetyl-D-mannosamine (Ac$_4$ManNAz), for up to 21 DIV. Two-color labeling shows that neuronal activities, such as neurite outgrowth and recycling of membrane components, are highly dynamic and change over time during development. In addition, the insertion sites of membrane components are suggested to not be random, but be predominantly localized in developing neurites. A semi-three dimensional, neuron-culture scaffold is designed and fabricated for induction of neuronal-circuit regeneration and advanced investigation of neuro-glycan, where astrocytes are encapsulated in the alginate microfibers. The astrocyte-encapsulating microfibers accelerate the neurite outgrowth, facilitate the synaptic formation, and guide the neurite elongation, without physical contact with neurons. The astrocytes in the microfibers, located nearby neurons in 100 μm, could support neuronal physiological activity and eliminate the toxicity of unnatural monosaccharide, peracetylated N-azidoacetyl-D-mannosamine. Therefore, spatial distributions of surface-glycoconjugates of hippocampal neurons cultured in three dimensional environment were showed. This study suggests a pivotal scaffold for advanced development of cell-based therapeutics for neural injuries, such as spiral cord injury, and a new research platform, advanced 3D systems, for metabolic-labeling studies of glycans in primary neurons.
글리칸(glycan)은 생체 내 작용들은 물론, 신경계의 병리·발달과정과 밀접하게 연관되어 있는 생체물질이다. 그러나 이러한 중요성에도 불구하고, 단백질 그리고 지질과는 다르게, 글리칸은 본질적으로 높은 다양성과 가변성으로 인해 연구가 쉽지 않은 실정이다. 이를 연구하는 방법은 당사슬에 결합할 수 있는 렉틴을 이용하거나 또는 당전이효소 유전자를 제거하는 것으로 굉장히 제한적이었다. 그러나, 1997년도에 세포내 대사과정을 이용한 염색법(metabolic labeling), 즉, 글리칸의 생화학적 합성과정을 통해 화학 탐침(chemical reporter)인 당변형체(unnatural monosaccharide)를 글리칸에 도입하는 방법이 개발되었다. 이는 단백질 또는 유전자를 거치지 않고, 직접적으로 글리칸을 화학적으로 변형시킬 수 있다는 장점이 있어, 세포 표면의 글리칸의 기능을 탐구할 수 있는 유용한 방법이다. 따라서 본 연구에서는, 세포 친화적인 대사염색법을 통해 신경세포의 글리칸을 화학적으로 표지하고, 그에 대한 역할 및 분포를 탐구하고자 하였다.우리의 뇌는 다른 신체장기들에 비해 시알산(sialic acid)의 구성비율이 높다. 그에 따라 시알산의 중요성이 강조되고 있으며, 최근 들어서는 뇌에서만 특이적으로 발견되는 폴리시알산(polysialic acid)의 기능이 더욱 부각되고 있다. 폴리시알산을 이용한 신경세포부착물질(neural-cell adhesion molecule) 번역 후 변형과정은 신경세포부착물질의 접착성을 조절하여 신경세포 발달과정에서 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 대사염색법을 이용하여 이 물질을 시각적으로 탐지 및 분석하였다. 본 연구에서 화학 탐침으로 사용된 당변형체(Ac4ManNAz)는 기존의 단일 신경세포에서 상당한 신경독성을 보였지만, 해마조직에 화학 탐침을 도입하는 방법인 조직기반 대사염색법 개발하였고, 이를 통해 신경독성 없이 해마신경세포 내 폴리시알산-신경세포부착물질의 시간적•공간적 분포를 탐구할 수 있었다. 그 결과, 폴리시알산-신경세포부착물질은 신경세포 발달과정 중 지속적으로 합성 및 대사회전이 되었으며, 특히, 2색 염색법을 통해 새롭게 합성된 폴리시알산-신경세포부착물질이 세포 몸체뿐 아니라, 성장중인 신경돌기에도 삽입됨을 알 수 있었다.세포 몸체뿐 아니라 다수의 신경돌기로 이루어진 신경세포에서는 글리칸의 시간적•공간적 분포는 더욱 중요하다. 특히, 뇌에서 세포표면 당질배합체(glycoconjugates)는 꾸준히 변화하며, 이는 신경발달단계에서 있어 생리학적 상태를 반영하는 중요한 단서지만 이것들의 기능 및 공간적 분포는 여전히 미지로 남아있다.이를 연구하기 위해 조직기반 대사방법을 이용하여, 시알산(Sia5Ac)과 N-아세틸 갈락토사민/글루코사민(GalNAc/GlcNAc)을 동시에 직교적으로 표지하여 염색하였다. 그 결과, 세포의 발달 초기상태에서는 각 당들이 무작위적으로 위치하였지만, 발달이 진행된 후에는 당에 따라 구별되는 분포를 보인다는 것을 밝혔으며, 이는 발달이 진행되면서 Sia5Ac와 GalNAc/GlcNAc 이방성으로 이동함을 시사한다.조직기반 대사염색법이 개발되었지만, 여전히 당변형체의 신경독성은 신경계 대사공학의 발전을 제한하였고, 그에 따라 신경세포 표면 당사슬의 대사염색은 어려운 과제로 남아있었다. 따라서, 차기연구에서는 조직대사염색법에 이어 당변형체의 신경독성을 중화시켜 줄 수 있는, 그리하여 신경세포 글리칸을 장기적으로 관찰 및 분석할 수 있는 신경세포-별아교세포(astrocyte) 공동배양 시스템을 개발하였다. 이 시스템에서 배양된 해마신경세포는 21일차까지 당변형체에 대한 독성 없이, 시알산 당사슬(sialoglycan)만 선택적으로 표지할 수 있었다. 또한, 시간차 2색 염색법을 통해, 신경세포의 생명활동 즉, 신경돌기 생장 및 세포막 구성물질 재활용 등이 굉장히 역동적이며, 세포의 발달상태에 따라 그 변화들이 다르다는 것을 밝혀내었다. 추가적으로, 세포표면이 확장될 때 표면구성물질은 신경돌기에서 우세하게 삽입된다는 것을 추론할 수 있었다. 마지막으로, 신경회로 재생 유도 및 신경 글리칸의 심화연구를 위하여, 별아교세포가 피포화된 하이드로겔 미세섬유로 이루어진 준삼차원의 신경세포배양 구조체를 제작하였다. 별아교세포가 내재된 미세섬유는 신경돌기 성장을 가속화 하였으며, 시냅스 형성을 용이하게 하였고, 또한, 신경돌기의 성장방향을 유도할 수 있었다. 미세섬유에 내포된 별아교세포는 신경세포와 가까이에 있어, 신경세포의 생리학적 활동에 직접적으로 도움을 줄 수 있으며, 대사공학을 위해 사용될 화학탐침인 당변형체의 독성 또한 감소시켜주어 대사염색을 가능하게 하였다. 본 연구를 통해, 삼차원 공간에서 성장한 해마신경세포 표면의 당질배합체의 공간적분포를 확인할 수 있었으며, 추후 신경손상 또는 척수손상을 위한 세포치료법에서 사용될 구조체로서의 가능성을 시사하였다.
