For diagnosing infections, a simple and facile assay which can be directly visualized with minimal technical requirements is in great need. Nucleic acid analytes is one of the most widely used for identification of molecular targets as biomarker in biomedical research. A rapid and simple detection method for nucleic acid anlaytes allows rapid diagnosis of disease and subsequent treatment. Nucleic acid amplification techniques are used for molecular biology research and medical diagnostics to specifically detect and analyze small amounts of genetic targets. Especially, the improved detectable signal can be achieved through integrated with nanotechnology. This paper is organized as follows.
In Chapter 2, we introduce a fluorescent nanosensor utilizing carbon dot nanoparticles that form visible precipitates in the presence of target DNA. Carbon dot nanoparticles were fabricated by microwave pyrolysis of polyethylenimine, which emitted strong photoluminescence and could form precipitates when added with target DNA oligonucleotides. The precipitates could be easily visualized by UV illumination, and data could be acquired as images using a smart phone which were analyzed for quantification. This carbon dot-based assay allowed fluorescent sensing of target oligonucleotides with various sizes, and visualization even with minimal amount of DNA (~100 pmol). Finally, the assay could be applied as a nanosensor platform for detecting bacterial DNA for the antibiotic resistance gene KPC-2 from Klebsiella pneumoniae. This method provides a simple technique for detecting molecular targets, showing wide applicability for diagnostics on the bedside or point-of-care testing.
In Chapter 3, we propose a simple paper-based fluorescent sensor for the detection of SARS-CoV-2 using isothermal amplification method, RCA. The fluorescent particles of solution on the filter paper are radially transferred to generate the fluorescent ring patterns by capillary phenomenon. During the RCA amplification process, a micron-sized ssDNA was produced in which a certain sequence is repeated, and this DNA was labeled through hybridization with probe-dye, which has the complementary sequence of RCA products, allowing to be concentrated fluorescent signal in the central droplets on the filter paper. The target can be detected simply by fluorescent ring pattern formed under a UV lamp after the droplet is completely spread within a few minutes. Furthermore, the assay is possible to detect the multiple targets by designed the different padlock templates and probe-dyes with various emission wavelengths. The assay can be a useful and easily applicable diagnostic tool for point-of-care detection of various infectious diseases such as COVID-19, bacterial infections.
We expect that the diagnostic platform, which is simple, easy-to-use compared to the existing technologies, developed in this study is possible to advance for self-diagnosis in the future through low-cost analysis equipment, allowing to change the place of diagnosis from hospital to home.
감염 진단을 위해서는 최소한의 기술적 요구 사항으로 직접 시각화 할 수 있는 간단하고 간편한 분석이 절실히 필요하다. 핵산은 생의학 연구에서 바이오마커로서 분자 표적을 식별하는 데 가장 널리 사용되는 물질 중 하나이다. 핵산 분석 물질에 대한 빠르고 간단한 검출은 질병을 신속하게 진단하고, 후속 치료를 가능하게 한다. 핵산 증폭 기술은 분자 생물학 연구 및 의료 진단에 사용되어 소량의 유전 적 표적을 특이적으로 탐지하고 분석한다. 특히, 나노 기술과의 통합을 통해 향상된 감지 신호를 얻을 수 있다. 본 학위 논문에서는 나노 소재를 사용하여 신속하고 간단하게 병원균을 검출할 수 있는 진단 플랫폼을 개발하여 소개한다.
2 장에서는 표적 DNA가있는 상태에서 가시적인 침전물을 형성하는 carbon dot 나노 입자를 활용한 형광 나노 센서를 소개한다. Carbon dot 나노 입자는 폴리에틸렌이민에 마이크로파를 가하여 열분해를 일으켜서 제조하였다. 이는 강한 형광 신호를 방출하고, 표적 DNA oligonucleotides를 첨가하면 침전물을 형성한다. 침전물은 UV 조명으로 쉽게 육안으로 확인 할 수 있으며, 스마트폰으로 이미지를 얻어 정량화를 위해 분석 할 수 있다. carbon dot 기반의 분석은 다양한 크기의 표적 oligonucleotides를 형광 신호를 기반으로 검출하고, 최소한의 DNA (~ 100pmol)로 육안으로 검출 가능한 침전물을 형성한다. 마지막으로, 이 분석법은 Klebsiella pneumoniae의 항생제 내성 유전자인 KPC-2를 검출하기 위한 나노 센서 플랫폼으로 적용하였다. 이 방법은 분자 표적을 검출하는 간단한 기술을 제공하여 병상 진단 또는 현장 진료 테스트에 폭넓게 적용 할 수 있음을 보여준다.
3 장에서는 등온 증폭법인 RCA를 이용하여 SARS-CoV-2 검출을 한 간단한 종이 기반 형광 센서를 제안한다. 용액의 형광 입자는 여과지에서 모세관 현상에 의해 방사형으로 이동하여 형광 링 패턴을 생성한다. RCA 증폭 과정에서 특정 염기 서열이 반복되는 마이크로 크기의 ssDNA가 생성되고, DNA는 RCA 산물에 상보적 염기 서열을 갖는 probe-dye에 의해 표지 되어 여과지에 떨어뜨린 액적의 중앙에 밀집한다. 액적이 몇 분 안에 완전히 퍼지면, UV 램프 아래에 형성된 형광 링 패턴으로 간단하게 표적을 검출 할 수 있다. 더욱이, 다양한 방출 파장을 가진 다양한 padlock template와 probe-dye를 설계하여 여러 표적을 검출 하는 다중 분석이 가능하다. 이 분석은 COVID-19, 박테리아 감염과 같은 다양한 감염성 질병의 현장 진단을 위한 유용하고 쉽게 적용 가능한 진단 도구가 될 수 있다.
우리는 본 연구에서 기존 기술들과 비교하여 분석이 간단하고, 사용이 쉬운 새로운 진단법을 개발하였다. 이러한 진단법이 향후 저가의 분석 장비를 통해 자가진단으로의 발전하여 진단의 장소를 병원에서 집으로 가져올 수 있으리라고 기대한다.
