Proteins are highly potent and specific with a low level of side effects compared to chemical drugs, hence taking up a very large proportion of the global pharmaceutical market. However, the short in vivo half-life and inefficient delivery imposes limitations on proteins being used in a wide range of applications. The stability of proteins has been improved by chemical modification and encapsulation into lipid vesicles or polymeric nanocapsules. Despite these efforts, proteins undergo insufficient delivery effects due to instability and low encapsulation efficiency according to harsh experimental conditions (high temperature, high pressure, use of organic solvents, etc.). In this study, a new strategy was established to self-assemble unilamellar lipid vesicles into multilamellar protein-lipid hybrid complexes by protein-mediated physical attraction, allowing proteins to maintain their stability and have high loading efficiency. The interaction between proteins and lipid membranes was identified to confirm the structure and formation mechanism of the complex, the structural, chemical, and biological stability of the protein in the complex, and its applicability. First, the protein-lipid complex was self-assembled with a combination of various proteins (anionic: epidermal growth factor (EGF), superoxide dismutase (SOD), ovalbumin (OVA), human serum albumin (HSA); cationic: insulin-like growth factor-1 (IGF-1), basic fibroblast growth factor (bFGF)) and lipid (cationic: 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP); anionic: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (POPG)) vesicles. The particle size, zeta potential, and structures at various proteins-lipids weight ratios were compared. Proteins and liposomes were simply mixed with mild conditions to prepare multilamellar protein-lipid vesicles (MPLVs). MPLVs generally exhibited increasing mean diameter and neutralizing the zeta potential by electrostatic attraction interaction between proteins and liposomes. Proteins generally had a loading efficiency of > 90 % in the complex and excellent long-term dispersion stability for 100 days. The optimal weight ratios for the complex between proteins and liposomes were different because of the different size and charge distribution of proteins. Second, the structure, assembly mechanism, and skin permeability of EGF-induced protein-lipid complexes were analyzed. EGF was structurally and chemically stable in EGF-DOTAP MPLVs, showing that activity was maintained for 100 days. The surface-side lipid molecules of cationic liposomes physically rearranged by EGF induced the engulfing-folding mechanism between liposomes, resulting in a multilamellar structure. EGF-DOTAP MPLVs increased the depth of penetration of EGF into the skin epidermal layer by about three than when only EGF was used. Third, an effective vaccine for antigen activity was developed by coating the surface of MPLVs prepared using OVA with an adjuvant. The particle surface charge was neutralized by coating the complex surface with negatively charged immune adjuvants, monophosphoryl lipid A (MPLA), for application in vivo. To confirm the vaccine effect of immune adjuvant coated-OVA-DOTAP MPLVs, antigen uptake, surface markers on cells, cytokines, and antibodies were analyzed using bone-marrow dendritic cells (BMDCs), spleen, and serum from mice. Through this study, the protein-lipid multilamellar structure with stabilization and high loading efficiency of proteins was designed in a very simple method using protein-mediated physical lipid membrane interfacial engineering without chemical bonding and harsh conditions. Researches in this Ph.D. thesis highlight that the self-assembled protein-lipid hybrid complex is a very stable and efficient carrier for protein in vivo delivery.
단백질은 화학 약품에 비해 높은 특이성과 낮은 부작용으로 잠재적인 효과가 높기 때문에 세계 의약품 시장에서 매우 많은 비율을 차지하고 있다. 하지만 체내에서의 짧은 반감기와 충분하지 않은 전달 효율로 광범위한 응용에는 한계가 있다. 단백질의 안정성은 화학적 결합이나 지질 소포체, 고분자 나노캡슐 등에 봉입하는 방법들로 개선되어 왔다. 이러한 노력에도 불구하고 단백질은 가혹한 실험 조건(고온, 고압, 유기용매의 사용 등)에 따른 불활성화와 낮은 봉입 효율로 인한 낮은 전달 효과를 보인다. 본 학위 연구에서는 단백질을 매개로 한 물리적인 인력만으로 단일 라멜라(uni-lamellar) 지질 소포체를 다층 라멜라 단백질-지질 하이브리드 복합체로 자기 조립시키면 단백질의 안정성을 유지하면서 높은 봉입 효율을 가질 것이라는 새로운 전략을 소개한다. 단백질-지질 사이의 상호작용을 파악하여 복합체의 구조와 형성 메커니즘, 복합체 내 단백질의 구조적, 화학적, 생물학적 안정성, 그리고 다양한 응용가능성을 확인하였다. 첫째로는 다양한 단백질(음이온성: 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 초과산화물 불균등화효소(superoxide dismutase, SOD), 난백알부민(ovalbumin, OVA), 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA); 양이온성: 인슐린 유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1), 염기성 섬유 아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF))와 지질(양이온성: 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP; 음이온성: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol), POPG) 소포체의 조합으로 단백질-지질 복합체를 자기 조립시켜 단백질마다 지질 소포체와 상호작용하여 나타나는 입자 특성, 구조, 그리고 상호작용 등을 비교하였다. 단백질과 리포좀은 가혹한 조건 없이 단순히 섞어 다층 라멜라 단백질-지질 소포체(multilamellar protein-lipid vesicles, MPLVs)로 제조하였다. MPLVs는 전반적으로 평균 지름은 증가하고 제타 전위는 중성화 되는 경향성을 보여 단백질과 리포좀 사이에 정전기적 인력을 통한 상호작용이 있음을 보였다. 단백질들은 대체적으로 90 % 이상의 봉입 효율을 보였으며, 매우 우수한 장기적인 분산 안전성을 나타냈다. 단백질과 리포좀이 복합체를 이루는 최적의 질량 비율이 다른 것은 단백질의 크기와 전하 분포에 의한 리포좀과의 상호작용이 모두 다르기 때문이다. 둘째로, EGF에 의해 유도된 단백질-지질 자기 조립체의 구조와 메커니즘, 그리고 피부 투과성에 대해 분석하였다. EGF는 EGF-DOTAP MPLVs 내에서 구조적, 화학적으로 안정하여 활성이 약 100일 동안 유지됨을 보였다. EGF에 의해 물리적으로 재배열된 양이온성 리포좀 표면의 지질 분자들에 의해 리포좀 사이의 먹힘-접힘 메커니즘이 유도되어 다층 라멜라 구조를 가지게 된다. EGF-DOTAP MPLVs는 EGF를 단독으로 사용했을 때보다 EGF가 피부 표피층으로 투과되는 깊이를 약 3배 이상 증가시켰다. 셋째로, OVA를 이용해 제조한 MPLVs의 표면을 면역 보조제로 코팅하여 항원 활성에 효율적인 백신을 개발하였다. 체내로 도입하기 위해 음전하 면역 보조제(e.g., lipopolysaccharide, monophosphoryl lipid A, CpG oligonucleotide)와 생분해성 고분자인 히알루론산(hyaluronic acids)으로 복합체 표면을 코팅하여 입자 표면 전하를 중성화 하였다. 면역 보조제가 코팅된 OVA-DOTAP MPLVs의 백신 효과를 확인하기 위해 in vitro 및 in vivo 상에서 마우스의 골수 유래 수지상세포(bone-marrow dendritic cells, BMDCs), 비장(spleen), 혈장(serum)으로부터 세포 내 함입(uptake), 세포 표면 마커(surface markers), 싸이토카인(cytokines), 항체(antibodies)를 분석하여 체액성 및 세포성 면역을 동시에 증진시킴을 확인하였다. 본 학위연구를 통해 화학적인 결합이나 가혹한 조건 없이 단백질 매개 물리적 지질막 계면 제어를 이용한 매우 간단한 방법으로 단백질의 안정화와 높은 봉입 효율을 갖는 단백질-지질 구조체를 고안하였다. 본 연구에서 단백질-지질 하이브리드 자기조립체가 생체 내 단백질 전달을 위한 매우 효율적이고 안정한 전달체임을 보였다.
