Spider silk, a protein-based fiber secreted by spider, has been extensively studied due to its superior mechanical properties and biocompatibility in comparison to other available synthetic materials. The cannibalism and aggressiveness of spiders made harvesting spider silk in large quantities through spider breeding impossible, and much effort has been made on recombinant production of recombinant spider dragline silk proteins in heterologous hosts and spinning them into artificial fibers. Nevertheless, such process has been severely hindered by the difficulty of producing recombinant spidroins in heterologous hosts, mainly due to the limitations of the recombinant hosts in production of the large, highly repetitive, glycine-rich recombinant silk proteins. This study aims to develop a metabolic engineering approach for enhanced production of a native-sized recombinant spider dragline silk protein as large as 284.9 kDa in Escherichia coli. Availability of tRNA$^{Gly}$ was improved through increasing tRNA$^{Gly}$ transcription. Translational elongation was enhanced by overexpressing elongation factors to cope with challenge on E. coli’s translation machinery for expression of large and repetitive spidroin. Recombinant spidroin expression level was further elevated by overexpressing chaperones that play a key role in folding of newly translated spidroins. Through fed-batch fermentation of the best strain, 3.68 g·$l^{-1}$ of this native-sized recombinant spider dragline silk protein was obtained, which is the highest titre ever reported for this size of recombinant spider dragline silk protein. The results in this study provide insight into metabolic engineering for enhanced production of other large, repetitive proteins in E. coli.
거미가 생산하는 단백질 기반 섬유인 거미줄은 다른 합성 섬유에 비해 우수한 기계적 특성과 생체 적합성으로 인해 광범위하게 연구되었습니다. 하지만 거미의 높은 공격성과 동족 포식 습성은 거미 양식을 통해 거미줄을 대량으로 수확하는 것을 불가능하게 만들었고, 이를 해결하기 위해 이종 숙주에서 재조합 거미실크 단백질을 생산하여 인공 섬유화 하기 위하여 많은 노력과 연구가 진행 되었습니다. 그럼에도 불구하고, 거미실크 단백질의 크기가 매우 크고 반복적인 구조를 형성하며, 글리신이 구성성분의 주를 이루고 있다는 특징 때문에 이종 숙주에서 재조합 거미실크 단백질을 생산하는 데에는 큰 어려움과 한계점이 있었습니다. 따라서, 이 연구에서는 대장균에서 284.9 kDa에 이르는 천연 크기의 재조합 거미 드래그 라인 실크 단백질의 생산을 향상시키기위한 대사 공학 접근 방식을 개발하는 것을 목표로 하였습니다. 본 실험을 통해 tRNA$^{Gly}$ 전사를 증가시키는 균주를 개발하였으며, 이를 통해 대장균의 tRNA$^{Gly}$ 가용성이 향상되었습니다. 대장균의 단백질 번역 과정에서 크고 반복적인 구조로 이루어진 거미실크 단백질의 발현의 어려움을 극복하기 위해 연신율를 과발현함으로써 번역 작용이 매우 향상되었습니다. 마지막으로, 재조합 거미실크 단백질의 발현은 단백질이 발현된 후 단백질의 올바른 구조를 형성하기 위한 폴딩에 중요한 역할을하는 샤페론을 과발현함으로써 더욱 높아졌습니다. 본 실험을 통해 제작된 균주의 유가식 발효를 통해 초고분자량 크기의 재조합 거미 드래그 라인 실크 단백질 3.68 g·l-1을 생산 할 수 있었으며, 이는 이 크기의 재조합 거미 드래그 라인 실크 단백질에 대해 보고된 가장 높은 생산능입니다. 이 연구의 결과는 대장균에서 다른 크고 반복적인 구조를 가지는 단백질의 생산을 향상시키기위한 대사 공학에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.
