Functional healthcare proteins, provide functional benefit to human, is essential bio-material in future bio-industry. They consist of enzymes, antibodies, growth factors, and cytokines to influence the cellular process and immune response and can be used in cosmeceutical, biopharmaceutical, biomarkers, and protein therapeutics. The eukaryotic cells were used to produce functional healthcare proteins due to the ability of the post-translational modification (PTM). However, because the production yield difficult to satisfy the demand, the prokaryotic expression system is still used as an attractive tool. For the effective production of functional healthcare proteins in Escherichia coli (E. coli) without loss of function, the protein tag and/or chaperone was used to increase solubility, purification efficiency, and production yield. Therefore, I designed fusion protein to produce target protein in the cytoplasm of E. coli.
In chapter 2, commonly used proteases, tobacco etch virus (TEV) protease and human enterokinase light chain (hEK$_L$) were produced in E. coli. I focus on the production of hEK$_L$ in E. coli which is needed for novel strategies which are fusion with maltose-binding protein, replacement of cysteine with serine, using the SHuffle as a host cell, and co-expression of chaperone.
In chapter 3, I designed the fusion protein to produce the recombinant N-terminal pro-brain natriuretic peptide (rNT-proBNP), a biomarker of heart failure, in E. coli with high-level productivity.
In chapter 4 and 5, I develop a bacterial expression system that produces high yields of soluble growth factors that can be purified in their native forms. The representative growth factors aFGF and VEGF165 were produced. Additionally, keratinocyte growth factor-1 (KGF-1) 135, the most stable form, and KGF-2 were produced by simple processes.
Through this research, various human-derived functional healthcare proteins could be produced in E. coli with high quality and high quantity to use the bio-industry.
인간에게 기능적 이점을 제공하는 기능성 건강 단백질은 미래 바이오산업에서 필수적인 생체 재료이다. 이들은 세포 수준의 여러 과정과 면역 반응에 영향을 미치는 효소, 항체, 성장 인자 및 사이토 카인으로 구성되며 코스메슈티컬, 바이오 제약, 바이오 마커 및 단백질 치료제에 사용될 수 있다. 기능성 헬스케어 단백질을 생산할 때는 번역 후 변형의 과정이 필수이기 때문에 진핵 세포를 숙주로 사용한다. 그러나 진핵 세포를 사용하였을 때, 생산 수율이 수요를 충족시키기 어렵기 때문에 원핵 세포를 사용한 발현 시스템은 여전히 매력적인 도구로 사용되고 있다. 기능의 손실 없이 대장균에서 기능성 헬스케어 단백질을 효과적으로 생산하기 위해 단백질 태그 및/또는 샤페론을 사용하여 용해도, 정제 효율 및 생산 수율을 높일 수 있다. 따라서 본 연구에서는 대장균의 세포질에서 표적 단백질을 생산하기 위해 융합 단백질을 설계하였다.
2 장에서는 일반적으로 사용되는 프로테아제인 담배 식각 바이러스 프로테아제 및 인간 엔테로키나아제 경쇄를 대장균에서 생산하였다. 인간 엔테로키나아제 경쇄는 대장균에서 생산하기 위해 새로운 전략이 필요하여 인간 엔테로키나아제 경쇄의 생산에 중점을 두었다. 인간 엔테로키나아제 경쇄를 말토오스 결합 단백질과 융합하였으며, 인간 엔테로키나아제 경쇄 내의 시스테인은 세린으로 대체되었고, 셔플 숙주 세포를 사용하였으며, 샤페론을 공동 발현하였다.
3 장에서는 심부전의 바이오 마커인 재조합 아민 말단 뇌 나트륨이뇨 펩타이드 전구체를 대장균에서 높은 생산성으로 생산할 수 있는 융합 단백질을 설계하였다.
4 장과 5 장에서는 인간 유래의 성장인자를 고유한 형태로 생산 할 수 있는 박테리아 발현 시스템과 고효율의 정제 공정을 개발하였다. 여러 개의 성장인자 중 대표적인 성장인자인 산성 섬유아세포 성장인자와 혈관내피세포 성장인자 165를 고농도 및 고품질로 생산하였다. 또한, 각질 형성 세포 성장인자-1의 여러 단편 중 가장 안정적인 형태인 각질 형성 세포 성장인자-1 135와 각질 형성 세포 성장인자-2를 간단한 공정을 통하여 생산하였다.
이번 연구를 통해 다양한 인체 유래 기능성 헬스케어 단백질을 대장균에서 고품질 및 대량으로 생산하여 바이오산업에 활용할 수 있게 하였다.
