Cancer is one of the leading causes of death worldwide despite great efforts to find new cures. Accurate diagnosis of cancer and therapy are both crucial in treating cancer. Various nanomaterials have been developed for diagnosis and therapy due to several advantages, such as high loading of cargo, increased retention time in vivo due to larger sizes, enhanced permeability and retention effects and feasibility of conjugating various functional moieties. Even so, limitations also exist as nanomaterials are mostly made of non-biodegradable inorganic material, and hence are not biocompatible. To overcome the shortcomings of nanomaterials, we have developed multi-functional biomaterials for cancer diagnosis and therapy.
In chapter 1, we focused on the development of a DNA probe set capable of comprehensive detection of exon 19 deletion mutation in non-small cell lung cancer. The DNA probe set, consisting of a molecular beacon and an oligo-quencher, was able to detect various deletion mutation types with high sensitivity. By detecting mutations in real-time PCR with extracted genomic DNA and in situ fluorescence imaging of cancer cells, diagnosis of exon 19 deletion mutation in non-small cell lung cancer was achieved.
In chapter 2, we developed a simple genetically encoded protein particle that targets cells in response to tumor microenvironment pH 6.5. The protein particle was produced by fusing a fluorescent mCherry protein and a fusogenic GALA peptide to the N and C-term, respectively, of a self-assembling ferritin core protein. pH sensitive cell targeting was verified with fluorescence activated cell sorting (FACS) and confocal cell imaging of various cancer cell lines. Furthermore, by fusing a translocation domain (TDP) of Pseudomonas aeruginosa exotoxin, mCherry proteins were delivered specifically to cells in response to the acidic pH 6.5.
In chapter 3, we developed a method to construct supramolecular protein assemblies using protein-ligand interactions in a programmable manner. The assemblies were constructed through a sequential growth from SpyCatcher/Tag and SnoopCatcher/Tag pair monomers. From just small monomeric proteins, assemblies as large as viruses were produced. Using fluorescent and therapeutic proteins as cargo, along with cell receptor binding domain and TDP domain, cell specific intracellular protein delivery was achieved. Cargos attached to the protein assembly showed enhanced cellular binding and thus increased therapeutic effects when compared to the monomeric forms.
In conclusion, we demonstrated the utility and potential of biomolecular nanostructures as biocompatible materials with high functionality for cancer diagnosis and therapy.
새로운 암 치료법을 찾기 위한 많은 노력에도 불구하고, 암은 전세계적으로 사망의 주요 원인들 중 하나다. 암 치료에 있어서 정확한 암 진단과 적절한 치료가 매우 중요하다. 암 진단 및 치료를 위해 다양한 나노 소재가 개발되어 왔다. 이러한 나노 소재는 진단과 치료를 위한 물질의 많은 적재, 큰 크기로 인해 증가된 체내 유지 시간, EPR (enhanced permeability and retention) 효과와 다양한 기능적 모이티의 결합이 가능한 점 등 여러 장점들이 있다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고, 나노 물질은 대부분 생분해성이 없는 무기물로 구성되어 생체적합성이 없기 때문에 생체에 적용하기에는 한계가 있다. 이러한 나노 물질의 단점을 극복하기 위해 암 진단과 치료에 활용할 수 있는 다기능 생체분자소재를 개발했다.
제1장에서는 비소세포 폐암에서 엑손(Exon) 19 삭제 돌연변이를 포괄적으로 검출할 수 있는 DNA 비콘 (beacon)을 개발했다. DNA로 이루어진 비콘과 짧은 디옥시리보핵산에 소광제(quencher)를 결합한 검출 센서는 굉장히 높은 민감도로 다양한 엑손(Exon) 19 삭제 돌연변이 유형을 검출할 수 있었다. 돌연변이 검출은 암세포에서 추출된 유전체를 실시간 중합효소 연쇄 반응과 암세포를 이용해 형광 공초점 현미경검사를 통해 비소세포 폐암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
제2장에서는 종양 미세 환경의 낮은 수소이온농도(pH 6.5)에 반응하여 세포를 표적 하는 다기능 단백질 입자를 개발하였다. 생체내 존재하는 ferritin 단백질의 N 과 C 말단을 mCherry와 수소이온농도에 반응하는 융해성 GALA 펩타이드를 융합하여 다기능 단백질 입자를 개발하였다. 개발된 단백질 입자는 수소이온농도에 반응하여 다양한 암세포를 표적할 수 있음을 형광 유세포분석(FACS)와 형광 공초점 현미경을 통하여 검증하였다. 또한, 녹농균 엑소톡신의 단백질 전달 도메인(TDP)을 이용하여 종양미세환경에 반응하여 mCherry 단백질을 세포질 안으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
제3장에서는 단백질 기반의 크기와 결합가(valency)를 조절할 수 있는 새로운 단백질 구조체를 제작할 수 있는 방법을 개발하였다. 단백질 구조체는 SpyCatcher/Tag 및 SnoopCatcher/Tag 의 상호작용에 기반하여, 단백질 단량체를 설계한 대로 단계적으로 조립하여 바이러스 크기의 거대 단백질 구조체까지 제작 할 수 있었다. 개발된 단백질 구조체는 다양한 cargo 단백질로 용이하게 기능화 할 수 있는 장점이 있다. 단백질 구조체를 박테리아 독소의 전달 도메인(translocation domain)과 세포 독성 단백질로 기능화 하여 cargo 단백질을 세포질 안으로 효율적으로 전달할 수 있었고 이를 통해 높은 세포 사멸효과를 얻었다. 단백질 구조체는 avidity 에 의해 표적 결합력이 증가되어 단량체 구조에 비해 세포 사멸 효과가 매우 높음을 확인하였고 이러한 특성을 갖는 단백질 구조체는 향후 생명공학 및 의료분야에서 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
결론적으로 본 연구에서는 암 진단과 치료를 위해 새로운 생체분자소재를 개발하였고 이를 암 세포의 민감한 검출, 종양 미세 환경에 따른 세포 표적, avidity 에 의한 치료 효능 증대에 활용할 수 있음을 입증하였다.
