Pso2, an exonuclease of the metallo-β-lactamase superfamily, plays an important role in DNA interstrand crosslink repair (ICL repair) in Saccharomyces cerevisiae. However, the enzymatic activity of Pso2 and its functions are largely unknown. Here, we report that Pso2 consists of two functionally distinct domains; an N-terminal domain (~204 amino acids) that could act as a regulatory domain, and a C-terminal domain (~457 amino acids) that possesses catalytic activity; the N-terminal domain exerts an inhibitory effect on the nuclease activity encoded by the C-terminal catalytic domain since proteolytic removal of the N-terminal 204 amino acids of Pso2 resulted in a marked increase of exonuclease activity. In keeping with this, purified recombinant Pso2Δ204N that lacks the first 204 amino acids exhibited robust nuclease activity. Extensive analyses of preparations of full-length Pso2 and a variety of truncated versions of Pso2 revealed that full-length Pso2 was extremely low in specific activity or virtually inactive. Our findings predict the existence of a mediator that can activate Pso2 by displacing its N-terminal domain in ICL repair. Despite the robust nuclease activity observed with Pso2Δ204N, however, pso2Δ204N mutants were sensitive to psoralen/UVA, a DNA interstrand crosslinking agent. This indicates that the catalytic activity of Pso2 alone is not sufficient for its adequate function in vivo. Analysis of Pso2Δ204N enzymatic activity revealed that Pso2Δ204N required a free 5’-PO4 to hydrolyze DNA and was a DNA-structure dependent exonuclease. Furthermore, we found that Pso2 was a multiple-copy suppressor of dna2Δ405N mutant at restrictive temperature, suggesting that Pso2 interacts genetically with Dna2 in DNA repair. In fact, genetic analysis of pso2Δ and dna2Δ405N double mutants indicated that Pso2 acted synergistically with Dna2 in ICL repair. Importantly, extensive analysis of pso2Δ mutant with other mutants (dna2Δ405N and exo1Δ) critical for double strand breaks (DSBs) end resection revealed that these nucleases shared the same DNA substrates, but acting in three different repair pathways. The active involvement of each nuclease in the processing of DSBs ends is dependent on the context of DSBs formation. Pso2 is critical for the processing of ICL-induced DSBs, while Dna2 and Exo1 play more significant roles than Pso2 in non ICL-induced DSBs end resection.
metallo-β-lactamase superfamily의 엑소뉴클레아제인 Pso2는 Saccharomyces cerevisiae에서 DNA interstrand crosslink repair에 중요한 역할을 한다. 그러나 Pso2의 효소 활성과 그 조절 방식은 거의 알려지지 않았다. 본 연구에서는 Pso2는 기능적으로 서로 다른 두 도메인인 조절 도메인으로 작용할 수 있는 N- 말단 도메인 (~ 204 개 아미노산) 과 촉매 활성을 보유하는 C- 말단 도메인 (~ 457 개 아미노산)으로 구성됨을 확인하였다. Pso2의 N- 말단 204 아미노산의 단백질 분해성 절단으로 인한 엑소뉴클레아제의 현저한 활성 증가를 통해 Pso2의 N- 말단 도메인은 C- 말단 도메인의 뉴클레아제 활성 효과를 억제한다는 것을 밝혀내었다. 마찬가지로 순수 정제한 처음 204 개 아미노산이 결여된 Pso2Δ204N 재조합 단백질 또한 강력한 뉴클레아제 활성을 나타내었다. 다양한 조각의 Pso2 활성 분석을 통해 full-length Pso2는 활성이 극도로 낮거나 사실상 비활성인 것을 확인 하였다. 본 연구 결과는 ICL repair에서 N- 말단 도메인을 대체하여 Pso2를 활성화할 수 있는 매개체의 존재를 예측할 수 있었다. 그러나 Pso2Δ204N으로 관찰된 강력한 뉴클레아제 활성에도 불구하고, pso2Δ204N 돌연변이체는 DNA 가닥 간 가교제인 psoralen/UVA에 민감했다. 이것은 Pso2 단독의 촉매 활성이 생체 내에서 적절한 기능을 수행하기에 충분하지 않음을 나타낸다. Pso2Δ204N 효소 활성 분석 결과 Pso2Δ204N는 DNA를 가수 분해하는 데 유리한 5'-PO4가 필요했으며 DNA 구조 의존성 엑소뉴클레아제였다. 또한, 우리는 Pos2가 제한적인 온도에서 dna2Δ405N 돌연변이의 다중 복사 억제자라는 것을 발견하였고 DNA repair 과정 중에 Pso2는 Dna2와 유전적으로 결합함을 암시한다. 사실, pso2Δ 및 dna2Δ405N 이중 돌연변이체의 유전적 분석은 Pso2가 ICL 복구에서 Dna2와 시너지 적으로 작용한다는 것을 보여주었다. 중요한 것은 dna2Δ405N, exo1Δ 돌연변이를 포함하여 이중 가닥 절단 (DSB) 말단 절제에 중요한 다른 돌연변이를 사용한 pso2Δ 돌연변이의 광범위한 분석은 이러한 뉴클레아제가 동일한 DNA 기질을 공유하지만 다른 복구 경로에서 작용함을 보여주었다. DNA 말단 절제에서 각 효소의 적극적인 관여는 DSB 형성의 맥락에 달려 있다. Pso2는 ICL 유도 DSB의 처리에 중요하지만 다른 Dna2 및 Exo1은 비 ICL 유도 DSB 말단 절제술에서 Pso2보다 더 중요한 역할을 한다.
