Membrane proteins must be inserted properly into biological membranes such as endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and plasma membrane for stable native structure and their own functioning. In terms of biogenesis, understanding how to be inserted and eventually form tertiary structure of membrane protein within the context of bilayer is essential key for elucidating membrane protein biogenesis. Although tracking the entire folding pathways of integral membrane proteins is directly breakthrough, it has remained yet to be achieved and demonstrated. This thesis demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique, especially magnetic tweezers, that allows us to monitor the entire folding pathways of alpha-helical membrane proteins in bilayer and bicelle environments. Firstly, we completely unfold the protein at high-force above 20 pN and then lower the force below 7 pN to induce initiation of folding from a loosely stretched state where the whole transmembrane helices are aligned in a zigzag manner within the bilayer. In the zigzag state, we could impose minimal constraints on the reconstituted folding process like the circumstance of second-stage folding. By using this membrane protein folding assay, we characterized the folding pathways of two integral membrane proteins: Escherichia coli rhomboid protease GlpG and the human $\beta_{2}$-adrenergic receptor ($\beta_{2}$-AR). Albeit their enormous evolutionary distance, the folding pathways share common features. Both proteins fold in a highly ordered process starting at the N-terminus, forming in units of helical hairpins. These common features do not only suggest that the folding pathways of integral membrane proteins have evolved to maximize their fitness with co-translational insertion, but also imply that this would allow these proteins to begin folding while being translated in the biological time-scale.
막 단백질은 안정된 구조상태를 갖고 그 고유의 기능을 수행하기 위하여 소포체막, 골지체막 그리고 세포외막과 같은 생물학적 막에 알맞게 삽입되어야 한다. 생물학적 발생의 측면에서, 막 단백질의 막 삽입과 최종적인 3차 구조 상태로의 접힘을 이해하는 것은 막 단백질의 발생을 설명하기 위하여 필수적인 요소이다. 막 단백질의 접힘 경로를 완전히 관찰하고 추적하는 것이 유일한 돌파구임에도 불구하고, 아직까지 많은 것들이 설명되고 해결되지 못했다. 본 학위 논문은 단분자 힘 분광기 기술인 자기집게를 이용하여, 막 환경내의 알파 나선 막 단백질이 어떠한 접힘 경로를 통하여 구조를 완성하는지 밝히는 과정을 담고 있다. 먼저, 막 단백질에 20 pN 이상의 높은 힘을 가하여 완전한 1차 구조로 푼 뒤, 다시 힘을 7 pN 보다 낮게 낮추어 제약조건이 거의 없는 지그재그 모양의 2차구조로 복원하였다. 이러한 지그재그 상태는 2차 구조의 나선들이 막에 일정부분 (~50%) 삽입되어 있기에, 2단계 접힘 모델을 충분히 묘사할 수 있다. 이러한 일련의 방법론을 이용하여, 2 가지 막 단백질 (GlpG와 $\beta_{2}$-adrenergic receptor) 의 접힘 경로를 밝혀냈다. 두 막 단백질의 진화적 거리가 매우 큼에도 불구하고, 그들의 접힘 경로는 공통적인 특징을 갖고 있었다. GlpG와 $\beta_{2}$-adrenergic receptor 모두 N 말단에서부터 C말단 방향으로 접힘이 진행되며, 나선2개가 하나의 단위를 갖고 점진적인 접힘을 한다는 것을 밝혔다. 이러한 공통적 사실은 단순한 우연이 아니라, 실제 생체 내에서 co-translational folding에 최적화 되어 진화되었다는 것을 암시한다. 또한, 막 단백질이 번역되고 삽입되는 시간 규모 내에서 부분 구조를 형성하여 접힘이 점진적으로 일어날 수 있다는 것 또한 시사하고 있다.
