To overcome petroleum-based fuel and chemical industries, various forms of biomass have been used as an alternative solution for environmental issues. Existing biomass using food and non-food biomass from agriculture and wood showed many limitations including ethical issue and lignin problem. Third generation of biomass from marine is expected for solution of sustainable technology. Macroalgae has higher carbohydrate content, lower amounts of inhibitor substrates, no ethical issue from food, and no climate change issue from fertilization. Among them, red algae have many advantages comparing the other macro-algae. It has many carbohydrates than the other macroalgae and agar is large partition of red algae; about ~52 wt % of dry Gelidium amansii. Its carbohydrate contents consist of only galactose and 3,6-anhydro-α-L-galactose. For utilization of agar with high efficient, saccharification of agar is important due to generation of 5-hydroxymethylfulfural, cell growth inhibitor during acidification of agar. To cope this problem, enzymatic process using agarase should be established. In this study, engineering of Corynebacterium glutamicum was performed to achieve agar utilization system for economical and sustainable production of various biochemical and recombinant protein. C. glutamicum has been used as an industrial workhorse, for production of amino acid including glutamic acid and lysine. There are various genetic tools and heterologous enzymes required to enable C. glutamicum to utilize agar. For high stable recombinant protein expression, stable gene expression system is required. There are several kinds and dosages of mobile genetic elements (MGEs) in bacteria. In a few cases, they had minimal effect on cells. However recently, there are reports that MGEs inserted into gene of interest and reduced production yield and quality. There are many MGEs in C. glutamicum. Highly active MGEs were elucidated by high throughput screening. High productivity of recombinant protein and biochemical were obtained by deletion of specific MGEs. Second, high gene expression system is required for production of target proteins or biochemical. Adaptive laboratory evolution was performed using fluorescence activated cell sorter as an artificial selection pressure. From this adaptive evolution, specific genetic mutation was identified in origin of plasmid increasing copy number. Therefore, high productivity of recombinant proteins was obtained. Third, endo type $\beta$-agarase secretion system was engineered by Tat-pathway dependent secretion. Endo type $\beta$-agarase is necessary for hydrolysis of agar and is hard to reach economical productivity. High productivity yield was obtained by high copy plasmid and co-expression of Tat-pathway transporter. Finally, engineered C. glutamicum produced 3,6-anhydro-$\alpha$-L-galactose using enzymatic saccharified agar as a carbon source. To perform this result, I screened exo-type $\beta$-agarase from marine bacteria resource. Novel exo-type $\beta$-agarases were identified and characterized. Co-expression of endo- and exo-type $\beta$-agarases was constructed and high productivity of both $\beta$-agarases was achieved by fed-batch fermentation. At the same time, galactose utilization was introduced into C. glutamicum which is unable to catalyze galactose. Galactose metabolic pathway was optimized, and expression of galactose transporter showed improved cell growth rate in galactose. By combining these result, high productivity yield of 3,6-anhydro-α-L-galactose was achieved. Consequently, high value-added products including neoagaro-oligosaccharide, 3,6-anhydro-$\alpha$-L-galactose, $\beta$-agarases will be produced in this platform. This is the first report of developing C. glutamicum strain capable of using agar as carbon source and contribute to economical bioprocess in bioindustry.
미생물을 이용한 바이오 산업이 발전하면서 다양한 탄소원을 이용하기 위한 바이오매스 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 기존의 제 1세대 바이오매스에 해당하는 식량자원기반 탄소원인 사탕수수, 옥수수를 넘어서 제 2 세대인 목재 기반 헤미셀룰로오스 기반 바이오매스의 연구가 이루어졌었다. 하지만 각 바이오매스는 불안정한 곡물가격, 윤리적인 문제, 낮은 전환률이 문제로 대두된다. 기존 바이오매스를 대체하기 위해서 제 3세대 바이오매스인 차세대 해양 바이오매스를 이용하고자 하는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 해양 바이오매스의 높은 생산성 및 경제성이 있기 때문에 앞으로도 이러한 연구 동향은 계속될 것으로 기대된다. 이중에서 홍조류 유래의 한천을 미생물이 이용하기 위해서는 당화과정이 필수적이다. 기존의 산을 이용한 당화과정의 경우 한천에 존재하는3,6-무수갈락토오스 (3,6-anhydro-$\alpha$-L-galactose)를 5-하이드록시메틸푸르푸랄(3-Hdroxymethylfurfural)로 전환시킨다. 이는 세포 성장을 저해하는 물질로써 한천 이용의 한계점으로 여겨진다. 이 한계점을 해결하기 위해서 효소적 당화과정 공정 설비가 필수적이다.
본 연구에서는 Corynebacterium glutamicum (코리네박테리움 글루타미쿰)을 이용하여 본 목표를 달성하고자 한다. 코리네박테리움은 병원성이 없는 균주로서 다양한 L-아미노산 그 중에서 글루탐산과 라이신을 생산하는데 많이 이용되는 균주이다. 그 밖에도 다양한 바이오케미컬을 생산하는 연구가 진행되고 있으며 단백질을 세포 밖으로 분비생산할 수 있는 능력을 통해 다양한 의약용 단백질 및 효소를 생산하는 사례들이 있는 균주이다. 본 논문에서는 이러한 유용한 코리네박테리움을 기반으로 한천을 대사하여 세포성장을 가능하게 하고 최종적으로 3,6-무수갈락토오스를 고생산할 수 있는 시스템을 개발하였다.
우선 다양한 유전자를 발현하기 위해서는 유전적으로 안정한 균주 개발을 진행하였다 (Chapter 2). 균주의 내부에는 전이인자와 삽입인자를 포함한 다양한 유전자 불안정한 요소들이 존재한다. 이 중에서 실제로 유전자 발현에 문제가 있는 요소를 효과적으로 스크리닝하는 방법이 필요하다. 이를 위해 형광단백질을 발현하는 플라스미드를 가진 세포를 배양한 뒤 유세포 분석기 (Fluorescence-activated cell sorter)를 통해 형광 분석을 진행하였다. 이 중에서 아주 적은 세포가 형광을 가지지 않고 있다는 것을 확인하고 이를 스크리닝하였다. 2번의 스크리닝 과정을 통해 형광단백질을 발현하지 못하는 세포를 확인하였으며 이를 분석한 결과 형광단백질 유전자에 균주에 존재하는 삽입인자가 들어가 있는 것을 확인하였다. 삽입인자 중 ISCg1과 ISCg2가 확인되었으며 여러 카피가 존재하는 각각 요소를 제거한 균주를 제작하였다. 그 중에서 ISCg2균주가 형광단백질, poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)], 감마-아미노산염을 통해 야생형 균주에 비해 높은 생산성을 보여주는 것을 확인하였다.
다음으로는 외래유전자를 효과적으로 발현하기 위하여 높은 카피 수의 플라스미드를 개발하였다 (Chapter 3). 앞선 연구에서 형광 스크리닝을 통해 형광이 없는 세포를 얻었다면 이번에는 형광단백질을 높게 생산하는 돌연변이 주를 얻기위해 적응진화를 진행하였다. 스크리닝 결과 기존 대비 4.5 배가 증가된 균주가 확인되었다. 다양한 분석을 통하여 변이된 균주는 야생형보다 카피 수가 10배 증가되었다. 또한 이러한 이유는 플라스미드 복제와 관련된 유전자인 parB가 발현되지 않도록 망가졌다는 것으로 확인하였다. 개량된 높은 카피 수를 통해 다양한 모델 단백질을 발현하였다. 자일란네이즈와 자일로오스를 크실론산으로 변형시키는Xylonate dehydrogenase를 발현한 결과 기존대비 각각 1.4 배와 1.5배가 증가된 생산량을 보여주었다.
한천을 효과적으로 분해하기 위해서 베타-아가레이즈의 대량생산 시스템을 구축하였다 (Chapter 4). 먼저 스트렙토마이세스 유래의 베타-아가레이즈인 DagA를 다양한 신호서열을 통해 분비생산을 시도하였다. 그 중에서 Tat-dependent pathway인 CgR09494를 통해서 분비생산한 결과 약간의 단백질이 분비되었다는 것을 확인하였다. 분비효율을 개선하기 위해서 Tat-dependent pathway 수송단백질을 동시 발현하였다. 이를 통해 성공적으로 세포 밖으로 DagA가 나가는 것을 확인하였다. 유가 배양식 발효를 통해서 고배양 생산 결과 원하지 않은 코리네박테리움 자체 단백질이 생산되는 것을 확인하였다. 이 단백질을 제거한 개량된 균주에서 발효결과 약 2 g/L의 DagA가 생산되었다는 것을 확인하였다.
최종적으로 한천을 이용하는 코리네박테리움 시스템을 제작하였다 (Cahpter 5). 앞선 연구에서 개발한 DagA 생산시스템 뿐만 아니라 Neoagarobiose를 생산하는 엑소형-아가레이즈가 필요하다. 기존에 존재하는 엑소형-아가레이즈를 발현한 결과 세포 내부에서만 생산되는 것을 확인하였다. 이를 개선하고자 기존에 알려져 있지 않은 엑소형-아가레이즈(EXB3)를 발굴하였고 코리네박테리움에서 고생산되는 것을 확인하였다. 앞서 제작한 시스템인 DagA 발현시스템에 EXB3 발현시스템을 통합하여 두가지 효소를 동시에 발현할 수 있었다. 발효로 생산된 아가레이즈가 한천을 효율적으로 분해하여 Neoagarobiose를 생산하였다. Neoagarobiose가 단당류인 갈락토오스와 3,6-무수갈락토오스로 분해하기 위해서 코리네박테리움에 Neoagarobiose hydrolase 발현시스템을 제작하였다. 한천을 효과적으로 분해하는 시스템을 제작하였지만 코리네박테리움을 기본적인 갈락토오스 대사능력이 없기 때문에 개량이 필요하다. 대장균으로부터 갈락토오스 대사 회로를 도입하였지만 높은 생장속도를 보여주지 않았다. 이를 개선하기 위해 발현 최적화 및 갈락토오스 수송단백질을 코리네박테리움 유전체에 삽입하여 갈락토오스를 이용하여 높은 세포성장할 수 있는 코리네박테리움 균주를 확보하였다. 마지막으로 앞서 제작한 시스템을 한 균주에 통합하여 제작하였고 한천을 효과적으로 대사할 수 있고 3,6-무수갈락토오스를 생산할 수 있는 코리네박테리움 균주 시스템을 완성하였다.
