The regulation of cellular functions require precisely tuned intensity, localization and duration of signaling events. Diverse systems has developed to study these studies. Notably, reversibility and spatio-temporal precision of optogenetics are an ideal means to study complex cellular dynamics. Although numerous studies presented optogenetic systems, further development, characterization and applications are needed. Here, specific light-response protein, cryptochrome 2 (CRY2) from Arabidopsis thaliana was engineered and characterized to further expand the optogenetic modules.In chapter 1, optogenetic modules was engineered to allow rapid and efficient protein oligomerization. By tagging different fluorescent proteins or a short peptide, the CRY2 reached a maximal oligomerization to generate a ‘cluster’, named CRY2clust. The veiled role of C-terminus of CRY2 was unraveled and application of CRY2clust on previously reported optogenetic modules remarkably enhanced the efficiency. In chapter 2, optogenetic technique called mRNA-LARIAT was developed to control mRNA localization and translation. The previously reported LARIAT (Light-Activated Reversible Inhibition by Assembled Trap (LARIAT) method was combined with conventional mRNA visualization system. With mRNA-LARIAT, light induces the sequestration of specific mRNAs into large protein clusters, altering mRNA localization and interfering with translation by limiting the ribosome interaction with trapped mRNA. The system is also sensitive and robust platform to visualize endogenous mRNA-protein complexes that have thus far been hardly detectable at the single-cell level due to low signal to noise ratio. With this method, the importance of newly synthesized β-actin molecules in fibroblast cell migration was discovered. This novel optogenetic modules are broadly applicable to study the causal relationships between mRNA or protein dynamics with various biological function and diseases.
세포 기능의 조절은 신호 이벤트의 정확하게 조율된 강도, 위치 및 지속 기간을 필요하다. 이러한 연구를 하기 위해 다양한 시스템이 개발되었다. 특히, 광유전학의 가역성과 시공간적 정밀도는 복잡한 세포 역학을 연구하는 이상적인 방법이다. 수많은 연구가 광유전학적 시스템을 제시했지만, 추가 개발, 특성분석 및 응용이 필요하다. 제 1장에서는 다양한 형광 단백질 또는 짧은 펩타이드를 이용해 새로운 광유전학 시스템 개발을 통해 신속하고 효율적인 단백질 복합체 형성을 가능하게 만들었다. 이 결과들을 바탕으로 이전에 알려져 있지 않은 크립토크롬 2의 역할을 밝혀냈고, 기존 기술에 이 기술을 적용하여 기능의 효율을 향상 시킬 수 있었다. 제 2장에서는 기존에 개발되었던 광유도 분자 올가미를 이용하여 전령 RNA의 위치와 번역을 제어하였다. 이 기술은 빛으로 단백질 복합체를 형성하여 특정 전령 RNA를 격리 시키는 기술이다. 격리된 전령 RNA는 리보좀과의 상호 작용을 제한하여 전령 RNA의 역할이 억제된다. 신호가 낮아 단세포 수준에서 거의 검출 할 수 없었던 전령 RNA와 단백질의 복합체를 민감하고 견고하게 시각화 할 수 있는 시스템이다. 이 기술을 통해 새롭게 합성된 β-actin 분자가 세포 이동의 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다.
