Small GTPases are important signaling node related in cytoskeleton and have critical role in oncogenesis and metastasis. However, specifically direct targeting of small GTPases have been challenging, such as KRas. Many researchers have been tried to develop an inhibitor against KRas but there are no FDA approved drug direct targeting KRas. Also, there have been developed various types of visualizing experimental tools about Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42) However, existing tools can visualize the artificially expressed target through new construct. Therefore, direct targeting agents are required for small GTPase research. Conformation-selective binding also has advantages at therapeutic strategies or imaging. It can reduce side effects or background signals, while all type of cells has small GTPases and basal level of their activities.
In chapter 1, we developed active-KRas specific repebodies. The selected protein binder, repebody can distinguish active KRas from inactive KRas and it can inhibit the protein-protein interaction between KRas and BRaf-RBD. In chapter 2, we developed active-Cdc42 specific repebodies to discriminate Cdc42 activity and their signaling network.
Conformation selective repebodies were selected through modified phage display screening, called soluble biopanning. Soluble biopanning using biotinylated target protein and streptavidin coated magnetic beads, was effective method to expose the loop conformation change of small GTPases. The selected repebodies were evaluated by immunoassay, pull-down assay, and co-immunoprecipitation. Additionally, the computational method, EpiScope, was applied to predict their epitope. The predicted epitope can explain the biochemical results.
The selected conformation-selective repebodies have been evaluated through biochemical methods, but for future application, further experiments are required to discriminate their therapeutic ability in cancer cells and tumor xenografted model animals. Additionally, dye optimization should be prior to apply live cell imaging.
저분자량 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질은 세포 골격과 관련된 중요한 신호 전달 중심으로 작용하여, 암의 발생과 전이에 핵심적인 역할을 한다. 그러나 이 단백질들을 직접적으로 저해하는 약물을 개발하는 것이 어렵다고 알려져 있다. 특히 중요한 표적인 케이 라스에 대하여 수많은 약물 개발 시도가 있었으나 허가 받은 직접 저해 약물이 없다. 또한 세포 내 단백질의 활성과 위치를 분석하기 위해 개발된 시스템들도 인공적으로 발현시킨 단백질들을 통해서 분석해야 했다. 따라서 활성을 띄는 저분자량 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질을 구별하여 인식하고 저해하는 물질의 필요성이 대두되어 이 연구를 진행하였다.
두 개의 목적 단백질에 대해 저해 약물 및 활성 연구에 대한 두 가지 목적을 가지고, 저분자량 단백질 내의 고리 구조 변화를 직접적으로 인식하는 결합 단백질, 리피바디를 개발하였다. 고리 구조 변화를 잘 노출시키도록 결합 단백질 선별 방법을 변화시켜 목적에 부합하는 리피바디를 개발하였다. 선별된 리피바디에 대한 생화학적 분석을 통해 목표하는 특성을 가짐을 확인하였고, 계산 생물학 방법을 도입하여 결합 부위를 예측하였다.
개발한 리피바디들에 대해 추가적으로 암 세포 및 암 이식 동물 모델에서의 특성 분석을 추가하면, 약물 및 시각화 도구로써의 개발을 완성하여 폭넓게 쓰일 수 있을 것으로 기대된다.
