With the rapid emergence of antibiotic microbial resistance (AMR) to all major classes of antibiotics and the decline in a number of potential candidates for new antibiotics, press an urgent need for the discovery of novel antibacterial compounds. Streptomyces, soil dwelling gram-positive bacteria, continue to be promising microorganisms for the production of clinically important secondary metabolites, including not only antibiotics, but also antiviral, antifungal, antiparasitic agents, antitumorals, and immunosuppressant compounds. Each Streptomyces species has the genetic potential to produce more than 30 secondary metabolites on average, which are diverse and differ between species. However, most secondary metabolite biosynthetic gene clusters (smBGC) are silent under laboratory culture conditions, limiting effective usage of Streptomyces. To overcome the limitation, the systematic understanding of the secondary metabolism and related regulatory mechanisms is required to reach the potential usage of the streptomycetes. In this study, I utilized three systematic approaches to discover novel smBGCs and elucidate multi-layered regulation on secondary metabolism of streptomycetes for enhancing secondary metabolite production.
First, we present 30 high-quality assembled streptomycetes genome sequences by a hybrid strategy using both long-read and short-read genome sequencing methods. The assembled genomes have more than 97.4% completeness with total lengths ranging from 6.7 to 10.1 Mbp. In average, the annotation identified 7,000 protein coding genes, 20 rRNAs, and 68 tRNAs. In silico prediction of smBGCs identified a total of 922 clusters, including many clusters unlinked to any known secondary metabolites production. In addition, smBGC analysis of the genomes revealed that S. venezuelae ATCC 14583, 14584 and 14585 possess the novel smBGC, producing anthelvencin. Through functional analysis of anthelvencin BGC encoded genes, I identified novel precursor synthesis gene and determined biosynthetic pathway for the anthelvencin. I anticipate that the availability of these genomes will accelerate a discovery of the novel secondary metabolites from Streptomyces and elucidation of complex smBGC regulation.
Second, a microbial coculture, which widely utilized method to activate silent smBGCs, between S. coelicolor and M. xanthus was applied to determine hidden layer for antibiotic biosynthesis. Through transcriptome analysis, we found that iron competition triggered antibiotic biosynthesis in Streptomyces coelicolor during coculture with Myxococcus xanthus. During coculture, M. xanthus enhanced the production of a siderophore, myxochelin, leading M. xanthus to dominate iron scavenging and S. coelicolor to experience iron-depleted conditions. This chemical communication, but not physical interaction, activated the actinorhodin biosynthetic gene cluster and the branched chain amino acid degradation pathway to supply a key biosynthetic precursor, acetyl-CoA, along with the activation of a novel actinorhodin export system. Furthermore, we found that the iron depletion increased the expression of 21 smBGCs in other Streptomyces species, as well. These findings suggested that the availability of key ions stimulated specific smBGCs, which had the potential to enhance secondary metabolite biosynthesis in Streptomyces.
Third, I systematically comprehended multi-layered regulation of secondary metabolism of streptomycetes at a molecular level, via completing the 7.9 Mb linear genome sequence of immunosuppressant agent tacrolimus (FK506) producer, Streptomyces tsukubaensis, and integrating the multi-omics measurements. Along with accurate re-annotation of the FK506 gene cluster, a total of 2,389 transcription start sites (TSS) and 1,270 transcript 3’end positions (TEP) were determined via primary transcriptome analysis. The integrated analysis of transcriptome and translatome data revealed that secondary metabolite gene clusters, especially the FK506 cluster, undergo translational regulation with decreased translational efficiency in accordance with growth. Furthermore, we demonstrated that AT-rich codons delay translational elongation, especially strong ribosome pausing was observed at the rare TTA codon in the FK506 cluster. In order to validate the phenomena, CRISPR/Cas9 mediated codon replacement was performed, resolving the ribosome pausing at the TTA codon and increasing the FK506 production. This integrated genome-scale analysis provide insight into multi-layered regulation on secondary metabolism of streptomycetes.
Overall, system biology approaches provides comprehensive understanding of secondary metabolism and potential targets for engineering the streptomycetes to optimize antibiotic production.
최근 감염병 치료의 필수 의약품인 항생제에 대한 다제내성균의 발생으로 신규 항생제 개발에 대한 필요도가 증가하고 있다. 하지만 1980년도 이후 개발되는 항생제의 숫자가 급감함에 따라 항생제 내성에 대처하기 위한 신규 항생제가 부족한 현실이다. 항생제는 이차대사산물의 한 종류이며, 토양미생물인 방선균 (Streptomycetes) 유전체에 존재하는 이차대사산물 합성 유전자 클러스터 (secondary metabolite biosynthetic gene cluster, smBGC)로부터 합성된다. 현재까지 개발되고 사용되어온 자연 발생 항생물질의 70% 이상은 방선균으로부터 생산되고 있다. 방선균은 한 종당 대략 30가지의 서로 다른 smBGC를 보유하고 있기에 신규 항생제 후보 물질 발굴에 있어서 가장 풍부한 자원으로 여겨지고 있지만 아직까지 방선균의 항생제 생산 능력이 충분히 활용되지 못하고 있다. 자연상태에서 방선균은 다양한 환경적인 스트레스와 주변 미생물과의 상호작용에 대한 반응으로 다종의 항생제를 생산하지만, 이러한 요인들이 존재하지 않는 실험실 배양조건에서는 방선균이 보유하고 있는 smBGC들 중 대부분이 발현이 되지 않는다. 효율적인 신규 항생제 개발 및 생산을 위해서는 방선균 내에 존재하는 항생제 생산과 관련된 유전자 조절기작을 분자 수준 (전사 및 번역수준)에서 이해하는 것과, 이를 바탕으로 발현되지 않는 smBGC를 활성화 시키는 것이 우선시 되어야한다. 따라서 본 연구에서는 세가지 시스템생물학적 접근을 통하여 방선균의 신규 항생제 합성 유전자 클러스터를 규명하고 항생제 생산 조절 기작을 규명하고자 하였다.
첫째로, 신규 항생제 합성 유전자 클러스터 규명을 위해, 방선균 30종의 게놈을 완성시킨 결과 6 ~ 10 mega base pair (Mbp) 규모의 고품질 유전체들을 얻었다. NCBI에 보고되어 있는 방선균 고품질 유전체 정보가 84종인 것을 고려하면, 이는 방선균 유전체 데이터베이스를 35%가량 확장시킨 결과라고 볼 수 있다. 30 종의 고품질 유전체 정보를 기반으로 200개 이상의 신규 smBGC를 포함하는 총 922개의 smBGC들을 발굴하였다. 이 중 10종의 Streptomyces venezuelae strain들이 보유하고 있는 smBGC들을 비교 분석함으로써 항생제이자 항암제로서의 기능을 가지는 anthelvencin 합성 유전자 클러스터를 찾았다. 클러스터 내 위치하는 유전자들의 기능 연구를 통해 anthelvencin의 전구체를 생산하는 신규 유전자를 발굴하였고, 더 나아가 anthelvencin 합성 경로를 규명하였다.
다음으로, 공생배양 (coculture)과 전사체 분석 (RNA-Seq)을 통해 방선균이 발현하지 않는 smBGC를 활성화시키는 조절 과정을 이해하고자 하였다. 방선균의 모델 균주인 Streptomyces coelicolor는 CTT 배양 조건에서 항생제인 actinorhodin을 생산하지 않지만, Myxococcus xanthus와 공생배양 할 경우 actinorhodin을 생산한다. 순수배양 과 공생배양 조건에서의 전사체 분석과 생화학적 분석을 진행한 결과, 이종간 Fe 이온에 대한 경쟁이 S. coelicolor의 actinorhodin 생산을 유도하는 것을 최종적으로 규명하였다. 추가적으로 Fe 이온의 양이 다른 방선균의 항생제 생산에 끼치는 영향을 확인하기 위하여, Fe 이온이 제한된 배양 조건에서 여덟 종의 방선균을 배양한 뒤 전사체 분석을 진행한 결과, 21개의 smBGC들의 전사 발현 양이 증가하는 것을 확인하였다. 이 smBGC들로부터 생산 될 것으로 예측되는 이차대사산물 중, actinorhodin을 포함한 여섯 개는 항생기능을 가지고 있을 뿐만 아니라 Fe 이온과 결합 및 상호작용할 수 있는 구조적인 가능성을 가지고 있었다. 주변 미생물 들과 Fe 이온에 대한 경쟁을 하고 있을 때 두가지 기능을 동시에 가지는 이차대사산물을 생산하는 것은 주변 미생물들의 접근을 차단하고 세포내 Fe 농도를 올림으로써 유리한 위치를 차지하기 위한 것으로 보여진다.
세번째로, 다양한 오믹스 연구를 통해 방선균의 전사, 번역 단계를 이해하여 이차대사산물 생산을 조절하는 기작들을 규명하고자 하였다. 면역억제제로 널리 사용되고 있는 FK506의 생산균주인 Streptomyces tsukubaensis의 게놈정보를 기반으로 유전체 수준의 전사체 구조를 규명하기 위하여 2,389개의 전사 시작 지점 (TSS)과 1,270개의 전사 종결 지점 (TEP)을 찾았으며 이 두 정보를 융합하여 총 1,225개의 전사 단위들을 결정하였다. 전사 단위들 상류와 하류의 유전체 서열을 분석하여 다양한 전사 수준 및 번역 수준 조절 인자들을 규명할 수 있었다. 다음으로 S. tsukubaensis의 성장단계에 따른 전사체와 번역체를 비교 분석하여 FK506 생산 관련 유전자들의 전사속도는 성장이 진행될수록 증가하지만 번역속도는 증가하지 않는 (translational buffering) 현상을 관찰하였다. 이러한 결과는 방선균을 이용해 항생제를 포함한 이차대사산물을 생산할 때 전사 수준 뿐 아니라 번역 수준을 고려해야 한다는 것을 시사한다. 번역 속도가 감소하는 원인을 찾기 위해 번역체 데이터를 코돈 수준에서 분석한 결과, 유전체 상 GC 비율이 높은 방선균에서 상대적으로 희귀한 코돈들인 AT 비율이 높은 코돈들에서 리보좀 멈춤현상이 관찰되었다. FK506 생산 관련 유전자들 중, 전구체인 allylmalonyl-CoA를 생산하는 유전자의 TTA codon에서도 강한 리보좀 멈춤현상이 확인되었으며, 이를 CRISPR/Cas9을 기반으로 한 코돈 엔지니어링으로 해소시킨 결과, FK506의 생산량이 증가하였다. 즉, 다양한 오믹스 분석을 통해 방선균의 이차대사산물 생산을 조절하는 새로운 기작을 밝힐 수 있었으며, 이를 이용하여 생산량을 증가시킬 수 있었다.
결론적으로, 세가지 시스템생물학적 접근을 통하여 방선균의 이차대사를 연구한 결과, 새로운 smBGC와 이로부터 생산되는 항생제의 합성 경로를 규명할 수 있었고, 발현되지 않는 smBGC를 활성화 시키는 기작을 밝혔으며, 이차대사산물 생산을 조절하는 다양한 수준의 조절 기작을 이해함으로써 논리적인 엔지니어링을 통해 이차대사산물 생산량을 증가시킬 수 있었다.
