Fluorescent labeling of proteins has been greatly important for bioimaging to study complex molecular mechanisms in cells. The yellow fluorescence-activating and absorption-shifting tag (Y-FAST) is a small size protein, which by addition of a fluorogen can be rapidly, and reversibly activated. However, an effective strategy for multiplexed imaging while allowing temporal control has been lacking. We have developed a multiplexed version of the Y-FAST protein by synthesizing different chromophores that allow fluorescence activation and spectral shifts in various wavelengths. The newly synthesized fluorogen, called gallic aldehyde-Rhodanine (GARho), can be easily produced by the simple Knoevenagel condensation reaction between rhodanine and gallolcontaining aldehyde, 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde. This is the first gallol-derivative study in which it is engineered to be a fluorophore for spectral tuning of protein. With the previously presented scaffold protein YFAST, the GA-Rho fluorogen bound to the protein exhibits red color fluorescent emission and reversibly turns on/off by PBS washing and rebinding of related fluorogens. The effects of binding of the fluorogens to Y-FAST were characterized using the purified protein and live-bacteria expressing the protein. Furthermore, we also demonstrated emission color interchanges of Y-FAST expressed in Escherichia coli via sequential treatment of spectrally tuned red, yellow, and green color fluorogens. This system can be widely applied as an adaptive reporter with dynamic temporal changes by multi-fluorescent emissions in living bacteria.
In chapter 1, introduction of fluorescent reporter system and fluorogen-activated reporter system are described.
In chapter 2, I will describe that Y-FAST and gallol derivatives can combine to emit fluorescence for each wavelength, thereby showing that it can be used as a dynamic and temporally controllable reporter system with multi-fluorescent emissions in live bacteria. In conclusion, this fluorescent reported system can potentially be applied to tag various target proteins for multiplexed imaging in living cells for study of drug bindinig, functions and signal.
세포의 복잡한 분자 메커니즘을 연구하기 위한 단백질의 형광 라벨링은 바이오 이미징에서 매우 중요하다. 황색 형광 활성 및 흡수 시프트 태그는 작은 크기의 단백질로 형광원을 추가하면 빠르고 가역적으로 활성화된다. 이전까지 시간적 제어를 허용하면서 멀티플렉스된 이미징을 위한 효과적인 전략은 부족했다. 따라서 우리는 다양한 파장에서 형광 활성화와 스펙트럼 이동을 가능하게 하는 서로 다른 크로모포어를 합성하여 황색 형광 활성화 및 흡수 이동 태그 단백질의 멀티플렉스 버전을 개발했다. 정제된 황색 형광 활성화 및 흡수 이동 태그 단백질과 이 단백질을 발현하는 살아있는 박테리아를 이용하여 형광원과 단백질 결합 시 형광이 활성화되는 특징을
파악하였다. 또한 본 연구에서는 식물에서 발견되고 어디서나 볼 수 있는 페놀 단위인 갈롤의 일부가 기능적으로 붉은색을 내는 형광원이 될 수 있다고 밝혔다. 이것은 단백질의 스펙트럼 튜닝을 위한 형광원 성분으로 개발된 최초의 갈롤 유도 연구다. 새로 합성된 형광원은 갈릭 알데히드-로다닌이라고 불리는데, 로다닌과 갈롤 함유 알데히드 3,4,5-트리히드록시벤츠알데히드 사이의 단순한 크뇌베나겔 축합 반응에 의해 쉽게 만들어질 수 있다. 이전에 언급한 황색 형광 활성화 및 흡수 이동 태그인 스캐폴드 단백질과 결합한 갈릭 알데하이드 로다닌은 적색의 형광 방출이 나타나며, 인산염완충액으로 워싱 또는 갈릴 알데하이드 로다닌 관련 형광원과의 재결합에 의해 형광의 켜짐과 꺼짐 현상이 나타난다. 또한 스펙트럼으로 튜닝된 적색, 황색 및 녹색 형광원 물질의 순차적 처리를 통해 대장균에 발현된 황색 형광 활성화 및 흡수 이동 태그 단백질의 방출색에 대한 상호 변화를 시연했다. 이 시스템은 앞으로 살아있는 박테리아에서 다발광 방출에 의한 동적 시간적 변화를 가진 적응형 리포터로 널리 응용될 수 있다. 이뿐만 아니라 하이드로 젤, 표면 코팅, 바이오 접착제 등 다양한 용도로 갈롤 파생상품의 광범위한 사용을 넘어, 갈롤을 매개하는 레드 컬러 개발은 페놀 파생 연구의 새로운 방향을 열어준다.
첫 번째 장에서는 살아있는 박테리아의 이미징을 위한 형광 시스템들에 대하여 대하여 우선 기술한 뒤, 기존의 황색 형광 활성 및 흡수 시프트 태그에 대하여 소개하였다. 이어서 파이로갈롤 유도체에 대해서 간략히 소개하였다.
두 번째 장에서는 위의 황색 형광 활성 및 흡수 시프트 태그와 갈롤 유도체가 결합하여 각각 파장별로 형광을 방출하고 이를 통해 박테리아의 다발광 방출에 의한 동적이고 시간적인 적응형 리포터 시스템으로 사용 가능함을 보여주었다. 끝으로, 이 형광 리포터 시스템은 약물 결합, 기능 및 신호에 관한 연구를 위해 살아있는 세포에서 멀티플렉스 영상촬영을 위한 다양한 표적 단백질의 태그를 부착하는데 잠재적으로 적용될 수 있음을 제시한다.
