Cell surface receptor oligomerization is an attractive target process for drug screening. However, Chapter 1 shows that simple but reliable (thus high-throughput) visualization methods for receptor oligomerization are still lacking. Chapter 2 describes the development of a new single-construct Homo-molecular Fluorescence Complementation (Homo-FC) probe, which shows strong fluorescence signals by oligomerization of fused receptors in living cells with unexpectedly low background signals. Importantly, this high signal-to-noise ratio was not affected by expression level variations of fused receptors. The Homo-FC probe was developed by optimized flopped fusion of split fragments of superfolder green fluorescence protein and subsequent surface charge engineering. Homo-FC reliably visualized oligomerization of diverse natural receptors such as GPCR, EGFR, and even cytosolic DAI.
By combining Homo-FC probe and photoactivatable proteins, Chapter 3 provides novel tools to monitor and regulate protein oligomerization in phase-separated condensates. Membrane-less organelles or compartments are considered as dynamic reaction centers for spatiotemporal control of diverse cellular processes in eukaryotic cells. Although their formation mechanisms have been steadily elucidated, biomolecular behaviors inside the compartments are largely unexplored. I quantitatively monitored protein interaction changes when client proteins were recruited into membrane-less compartments formed in living cells. Fluorescent protein (FP) probes, which generate fluorescence signals upon self-interaction or -complementation, were used as clients. I organized cellular compartment formation by tandemly repeating or clustering intrinsically disordered proteins (IDPs), which are primary scaffold proteins to form membrane-less organelles in cells. Client probe recruitment into these IDP compartments was controlled by fusing different IDPs to clients, where IDP-fused clients can be enriched inside compartments via diverse IDP-IDP interactions. I observed vastly increased FP probe interactions inside IDP compartments, although inner probe enrichment was only marginal (2-3 fold), suggesting that inner compartment nature such as percolated protein network structures can accelerate protein interactions. Real-time imaging of compartment formation and subsequent client interactions indicated that IDP-mediated client recruitment can be an instant process, where client interaction signals reached maximums within 4 min. I also observed that client recruitment and interactions inside compartments greatly varied by client-fused IDPs, suggesting a nature’s potential selection strategy to enrich specific sets of biomolecules inside membrane-less organelles.
세포는 세포막 수용체를 통해 외부 신호(정보)를 수신하고 이러한 신호를 통합하여 세포 증식, 운동성, 분화 및 사멸과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 많은 경우, 이러한 과정은 이들 수용체의 올리고머화(oligomerization)를 동반하며, 이는 복잡한 수용체 활성화 조절 과정의 핵심적인 부분이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체의 가장 큰 계열을 구성하는 G-단백질 결합 수용체 (G-protein coupled receptors; GPCR)는 다양한 올리고머 상태로 존재하거나 기능하는 것으로 알려져 있다. 또한 수용체 티로신 키나아제 EGFR의 올리고머화가 EGFR 활성화의 조절 및 신호 전달에 많이 관여한다는 것도 잘 알려져 있다. 이렇듯 수용체 올리고머화는 광범위한 질병들과 관련되어 있으며 리간드 스크리닝 및 약물 발견을 위한 매력적인 잠재적 표적 과정이다.
1 장에서는 세포 내에서 다양한 막 수용체의 올리고머화를 확인하고 모니터링하기 위해 연구되어온 다양한 생화학적 기술에 대해 소개한다. 현재까지 단순하며 신속하게 막 수용체의 올리고머화를 직접적으로 확인할 수 있는 높은 신뢰도를 가진 방법은 개발된 바 없다. 따라서 살아있는 세포에서 수용체 올리고머와 관련 된 치료용 분자의 하이-스루풋 스크리닝(High-Throughput Screening) 을 위한 신뢰성 있고 강력한 시각화 방법이 요구된다.
2 장에서는 새로운 Homo-molecular Fluorescence Complementation (Homo-FC) 프로브의 개발에 대해 설명한다. Homo-FC 프로브는 분리된 두개의 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (Superfolder GFP)의 단편(1-7,8-11 스트랜드)을 분자간 상보성만 허용되는 단일 단백질 구조로 연결(8-11)-linker-(1-7)하여 개발하였다. 이 프로브는 매우 낮은 배경 신호(Background Signal)를 가지고 있으며 세포내 수용체들 간 올리고머 화가 일어날 때만 강한 형광 신호를 만들어낸다. 또한 프로브의 높은 S/N (Signal to Noise) 비는 수용체의 발현 수준 변이에 의해 영향을 받지 않았다. Homo-FC는 GPCR, EGFR 및 심지어 cytosolic DAI와 같은 다양한 생체 수용체의 올리고머 화를 높은 S/N (Signal to noise) 비로 시각화 하였다.
3 장에서는 Homo-FC 와 광유전학기술을 결합하여 세포 내 상분리현상을 실시간으로 유도하고 상 분리된 응집체 내에서 일어나는 특별한 현상을 시각화 하는 연구에 대해 소개한다. 진핵 세포에서 막이 없는 소기관 및 구획들은 세포 내에서 일어나는 다양한 반응들의 시공간적 조절을 위한 동적 반응 센터로 간주된다. 막이 없는 소기관들의 형성 메커니즘은 꾸준히 설명되었지만, 이들 내부에서 일어나는 생체 분자 거동은 많이 연구되지 않았다. 이에 우리는 상 분리 현상을 일으키는 단백질로 알려진 IDP (Intinsically disordered protein) 단백질과 빛에 반응하여 oligomer화를 일으키는 CRY2 단백질을 통해 상분리 된 응집체를 만들고 Homo-FC 프로브가 fusion된 IDP-HomoFC 단백질이 응집체 내부로 모집(recruitment) 될 때 일어나는 단백질 상호 작용 변화를 실시간으로 모니터링 하였다. 그 결과 내부로 모집되는 프로브의 농도가 단지 2-3 배 증가했음에도 IDP 구획 내부에서 프로브 간 상호작용이 크게 증가하는 것을 정량적으로 확인하였다. 구획 내부의 특별한 환경이 단백질 상호 작용을 가속화 할 수 있음을 시사한다.
