Discovery and engineering of fluorescent proteins have largely contributed to the technologies that trace dynamic changes of intracellular protein activities. Such effort is remarkable since isolating the function of a protein in the homeostasized nature of signaling network is critical when tracking back abnormal signaling processes in the disease state. Ras and Rho small GTPases are critical for numerous cellular processes including cell division, migration, and intercellular communication. Despite extensive efforts to visualize the spatiotemporal activity of these proteins, achieving the sensitivity and dynamic range necessary for in vivo application has been challenging. Here, we present highly sensitive intensiometric small GTPase biosensors visualizing the activity of multiple small GTPases in single cells in in vivo. Red-shifted sensors combined with blue light-controllable optogenetic modules achieved simultaneous monitoring and manipulation of protein activities in a highly spatiotemporal manner. Our biosensors revealed spatial dynamics of Cdc42 and Ras activities upon structural plasticity of single dendritic spines, as well as a broad range of subcellular Ras activities in the brains of freely behaving mice. Thus, these novel intensiometric small GTPase sensors enable the spatiotemporal dissection of complex protein signaling networks in live animals.
형광 단백질의 발견 및 개발은 세포 내 단백질 활동의 동적 변화를 추적하는 기술에 크게 기여해 왔습니다. 특히, 세포 내 항상성이 유지되어 있는 상태에서 단일 단백질의 기능을 관찰 할 수 있어 의미를 가지며, 질병연구에서 비정상적인 신호전달과정을 추적 할 수 있어 중요합니다. Ras 및 Rho small GTPase는 세포 분열, 이동 등 다양한 세포 과정에 기여합니다. 이러한 단백질의 시공간적 활동을 시각화 하기위한 광범위한 노력에도 불구하고, 생체 내 적용에 필요한 감도와 동적 범위를 보유하는 바이오센서의 개발은 제한적이었습니다. 따라서 생체 내 단일 세포에서 여러 small GTPases의 활동을 시각화하고 고감도 성능을 보유한 intensiometric small GTPase 바이오 센서를 개발 하였습니다. 적색으로 개량된 바이오 센서는 청색광유전학 제어기술과 간섭없이 동시에 사용이 가능하다는 장점이 있으며 고도의 시공간적 단백질 활동을 조작하고 동시에 모니터링 할수 있습니다. 또한, 고감도 성능을 통해 Cdc42, Rac1 그리고 Ras small GTPase 단백질의 기능을 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 현상과 관련하여 해석 할 수 있었습니다. 이와 더불어 자유롭게 행동하는 생쥐의 뇌에서 다양한 세포 내 Ras 단백질의 활성을 최초로 관찰 하였습니다. 개발한 바이오센서는 생명체의 복잡한 신호 네트워크 상의 단일 단백질 기능을 시공간적으로 구획화 할 수 있었으며, 다양한 생명현상과 small GTPase 단백질 기능을 관련짓는 연구에 기여 할 것이라 기대 합니다.
