Herein, we developed a three-way junction (3WJ) structure-induced isothermal amplification reaction (ThIsAmp) using specially designed combinatorial probe for nucleic acid detection. In this strategy, we employed specially designed ThIsAmp template which can serve as a component of 3WJ structure as well as an EXPAR template. In the presence of target DNA, ThIsAmp template is hybridized with target DNA and ThIsAmp primer which is additionally introduced to form the 3WJ structure. After the 3WJ structure is formed, the trigger strand is generated by DNA polymerase and nicking endonuclease. The produced trigger strand then induces two pathways for double-stranded ThIsAmp template (dsDNA product) amplification. First, the trigger strand binds to the 3’ end region of ThIsAmp template in 3WJ-structure, then polymerase extends the 3’ end of trigger strand, consequently generating the dsDNA product and releasing the target DNA from the 3WJ structure (pathway 1). Second, the trigger strand binds to free ThIsAmp template, which promotes exponential amplification of dsDNA products by following the conventional EXPAR system (pathway 2). As a result of the pathway 1 and 2, a lot of dsDNA products are produced and its fluorescence intensity is monitored in real-time by SYBR Green I staining. By employing newly designed probes, we finally developed the novel isothermal nucleic acid amplification strategy which can overcome the critical disadvantage of conventional EXPAR technology which has difficulty in detecting a 3’-OH-less nucleic acid or a nucleic acid whose length is too long to be used as a primer for EXPAR. Based on this strategy, we successfully detected target nucleic acid with the high specificity and sensitivity in the dynamic range of 1 fM to 1 nM with a low detection limit down to 78.1 aM.
본 연구에서는 표적 핵산 검출을 위한 새로운 통합 프로브를 이용한 삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 방법을 개발하였다. 제시된 기술에서는 삼중접합구조 구성 가닥과 EXPAR 템플릿 역할을 함께 수행할 수 있는 새로운 통합 프로브 (이하 ThIsAmp 템플릿)가 이용된다. 표적 핵산의 존재 시, ThIsAmp 템플릿과 프라이머와 결합을 이루어 삼중접합구조 생성을 유도한다. DNA 중합 효소와 절단 효소에 의해 생성되는 트리거는 두 가지 경로로 최종 이중가닥 DNA 산물 (이하 dsDNA)의 생성을 촉진한다. 첫째, 트리거가 DNA 삼중접합구조 내의 ThIsAmp 템플릿과 결합하는 경우, DNA 중합 효소의 작용으로 인해 dsDNA가 생성되고 표적 핵산은 방출되어 새로운 삼중접합구조를 만드는데 사용된다. 둘째, 트리거가 반응에 참여하지 않은 새로운 ThIsAmp 템플릿과 결합하는 경우, DNA 중합 효소와 제한 효소의 작용으로 dsDNA가 지수함수적으로 증폭된다. 위의 반응들로 생성되는 dsDNA의 형광 신호를 실시간으로 분석한다. 본 기술은 뛰어난 민감도와 선택도를 가지며, 기존 EXPAR 기술의 단점인 3’-OH 말단을 갖는 짧은 표적 핵산 검출에만 사용 가능하다는 제한적인 활용범위를 극복했다는 데 큰 의의가 있다.
