To understand molecular properties, it is essential to investigate the molecular structure and related chemical reactions. Especially, a molecular structure evolves as a chemical reaction proceeds through metable states on the reaction coordinate called reaction intermediates. Three-dimensional structures of the reaction intermediates determine products of the reaction and the reaction pathway and thus structures of the intermediates can provide fundamental information to understand and control the reaction. Reaction dynamics of a number of chemical reactions have been investigated by various experimental techniques such as X-ray crystallography, electron diffraction, solution scattering, nuclear magnetic resonance (NMR), and spectroscopies, however, it is still challenging to elucidate reaction mechanisms with high spatiotemporal resolutions. Time-resolved X-ray solution scattering has been established recently and it is relevant for probing fast and subtle structural changes in solution. In a time-resolved X-ray solution scattering experiment, a chemical reaction is usually triggered by a laser pulse and subsequent structural changes of the molecule are detected by X-ray scattering signal as a function of time. X-ray scattering signal are dependent on positions of all constituent atoms in a molecule so that it can provide information on global structure of the molecule. It is complementary to spectroscopic techniques that are usually sensitive to structures and energies nearby chromophores. Time-resolved X-ray solution scattering can be applied to various molecules ranging from small molecules to large protein molecules in solution. We employed this technique to proteins such as homodimeric hemoglobin and hemoglobin which exhibit allosteric effects and myoglobin to investigate structural dynamics of them upon photodissociation of carbon monoxide ligands. We also applied the technique to a gold complex to visualize bond formation process. Furthermore, we investigated rotational dephasing process of the gold complex by monitoring evolution of orientational distribution of excited molecules and derived formula for calculating X-ray solution scattering intensity arising from an anisotropic orientational distribution of molecules.
Hemoglobin acts as an oxygen carrier in the human body by binding biatomic ligands up to four ligands. Binding affinity of a ligand is altered by ligand-binding states of other subunits and this is called as the allosteric effect. Homodimeric hemoglobin is more convenient molecular system to study the allosteric effect since it has homodimeric structure, simpler than the heterotetrameric structure of hemoglobin. Time-resolved X-ray solution scattering was employed to investigate the allosteric structural transitions in homodimeric hemoglobin. The kinetic and structural analyses on the data revealed detailed structural parameters such as intersubunit rotation angle and heme-heme distance of three reaction intermediates as well as kinetic parameters related to transitions among the intermediates. We extended the study toward F97Y and T72V mutants to figure out effects of the heme movement and water cluster at the subunit interface on structural dynamics of homodimeric hemoglobin. Acceleration of overall reaction kinetics and attenuation of ligand-linked heme movement were observed for the F97Y mutant. We also found that intersubunit communication is increased in the T72V mutant. Along with homodimeric hemoglobin, hemoglobin and myoglobin were investigated as well with time-resolved X-ray solution scattering. From those experiments, reaction kinetics of hemoglobin was identified and tertiary structural information of the earliest myoglobin intermediate was extracted.
As X-ray free electron lasers (XFEL) have operated, achievable temporal width of an X-ray pulse has been decreased down to 100 fs. As a result, experimental time resolution of time-resolved X-ray solution scattering has improved up to sub-picoseconds. By making use of femtosecond X-ray pulses generated at an XFEL, we observed the moment of bond formation in a gold trimer complex, $[Au(CN)_2^-]_3$, in solution. Bond formations between the adjacent gold atoms in the gold complex can be triggered by laser excitation and the bond formations proceed without limitations by slow diffusion. This is because the constituent gold atoms are gathered together in a solvent cage by a relativistic effect called aurophilicity. We monitored distances among the gold atoms after laser excitation. As a result, we observed the bond formation as well as a bent-to-linear structural transition within 500 fs. Further contraction of bond lengths and formation of a tetramer complex were observed as well. We also revealed rotational dephasing process of the gold complex by tracking evolution of transient anisotropy generated by a linearly polarized laser.
X-ray solution scattering signal has relatively low information content compared to X-ray crystallography owing to random orientation of molecules in solution. One of the compensations for the information loss is to make anisotropic orientational distribution of excited molecules using a linearly polarized laser. By the linearly polarized laser, excited molecules in solution are photoselectively aligned so that arise an anisotropic X-ray scattering pattern. By changing the direction of laser polarization, we can obtain distinct anisotropic X-ray solution scattering patterns, indicating increase of information content. To interpret the experimental anisotropic X-ray solution scattering signal, a methodology for calculating X-ray scattering signal for the anisotropic orientational distribution is required. Furthermore, it is essential to analyze femtosecond X-ray solution scattering data since scattering signal measured at time delays earlier than a rotational dephasing process is not isotropic anymore. We derived a formula for calculating anisotropic X-ray scattering intensities and demonstrated expected amount of the information content.
분자의 구조와 그 분자와 관련된 화학 반응을 이해하는 것은 분자의 성질을 이해하기 위해 필수적이다. 특히, 분자는 화학 반응이 진행됨에 따라 삼차원 구조가 변하게 되는데, 그 과정에서 반응중간체가 생기고, 반응중간체의 구조는 반응 경로와 생성물을 결정하는데 핵심적인 역할을 한다. 따라서 반응중간체의 구조에 대한 이해는 반응을 완전히 이해하고 원하는대로 제어하기 위한 핵심 정보가 된다. 그동안 X-선 결정학, 전자 회절, 용액상 산란법, NMR, X-선 분광학 등의 물리화학적 실험 기법을 통해 화학 반응 동력학이 연구되어져 왔지만, 아직도 높은 시공간분해능으로 반응의 메커니즘을 밝히는 일은 어려운 과제이다. 최근에 개발된 시간분해 X-선 산란법은 용액상 반응동력학을 연구하기 위해 적합한 실험적 방법으로 높은 시공간분해능으로 반응의 진행과정을 시각화할 수 있다. 이 방법에서는 보통 레이저 펄스에 의하여 반응이 개시되고, 그 이후 진행되는 분자의 구조 변화를 시간에 따른 X-선 산란 신호의 변화를 통해 분석하게 된다. X-선 산란현상은 분자 내 모든 원자에서 일어나기 때문에 분자의 전체적인 구조 변화에 대한 정보를 제공하는데, 이에 따라 분광학적 실험 기법들이 흡광단 주변의 구조 및 에너지 변화에 민감한 것과 상호보완적인 정보를 제공할 수 있다. 시간분해 X-선 산란법 실험은 용액상 작은 분자에서 거대한 단백질 분자에 이르기 까지 다양한 시료에 적용될 수 있다. 이를 이용하여 다른자리 입체성 효과(allosteric effect)를 갖는 동종이합체 헤모글로빈(homodimeric hemoglobin), 헤모글로빈(hemoglobin) 단백질과 미오글로빈(myoglobin) 단백질의 리간드 광분해 이후의 구조동력학 연구를 수행하였다. 한편, 금 삼합체(gold trimer complex)와 같은 작은 분자에도 적용하여 금 삼합체 내부의 화학 결합이 형성되는 순간을 관측하고자 하였다. 마지막으로 레이저 여기에 의해 생기는 들뜬 분자의 비등방성 배열로부터 rotational dephasing 과정에 대한 연구를 진행하였고, 분자의 비등방성 배열로부터 얻어지는 산란 이미지를 분석하기 위한 이론적 연구를 진행하였다.
헤모글로빈 단백질은 이원자 분자 리간드를 네 개까지 결합할 수 있어 체내의 기체 산소 전달에 관여하는데, 리간드의 결합력은 다른 서브유닛의 결합 상태에 따라 달라지게 된다. 이런 현상을 다른자리 입체성 효과라고 하는데, 이를 연구하기 위한 좋은 모델 시스템이 구조가 좀 더 단순한 동종이합체 헤모글로빈이다. 동종이합체 헤모글로빈은 동일한 두 개의 서브유닛으로 구성되는데 다른자리 입체성 효과에 대한 이해를 돕기 위해 광분해 이후의 구조동력학을 연구하였다. 그 결과, 리간드의 광분해 이후 세 개의 반응중간체가 생성됨을 확인하였고, 각 반응중간체의 서브유닛 회전 각도와 두 서브유닛의 헴기 사이의 거리와 같은 구체적인 구조 변화를 관측할 수 있었다. 더 나아가 헴기의 움직임과 서브 유닛 경계의 물 분자들의 숫자가 구조동력학에 미치는 영향에 대해 파악하기 위하여 F97Y와 T72V 변이 단백질에 대한 실험도 병행하였다. 그 결과, F97Y 변이 단백질에서는 전체적으로 반응이 빠르게 진행되고, 세 번째 반응중간체에서 헴기의 움직임이 제한되는 것이 관측되었고, T72V 변이 단백질에서는 두 서브유닛 사이의 상호작용이 증가하는 것이 관측되었다. 동종이합체 헤모글로빈 외에도 헤모글로빈과 미오글로빈 단백질에도 시간분해 X-선 산란법을 적용하여 헤모글로빈의 리간드 광분해 반응 이후에 나타나는 반응중간체와 그 사이 전이에 대한 키네틱스 정보를 얻을 수 있었고, 미오글로빈의 첫 번째 반응중간체에서 나타나는 삼차구조의 변화를 밝혀낼 수 있었다.
X-선 자유전자 레이저가 가동됨에 따라 엑스선 펄스의 시간폭이 100펨토초 이하로 줄어듦에 따라 실험의 시간분해능이 1피코초 이내로 향상되었고, 이를 이용하여 금 삼합체 내에서 일어나는 화학 결합의 형성 순간을 관측할 수 있었다. 금 삼합체 화합물($[Au(CN)_2^-]_3$)은 레이저 펄스에 의해 화학 결합이 야기되는데, 바닥 상태에서도 상대적효과에 의해 금 원자들이 인접한 곳에 위치하고 있기 때문에 확산 과정에 의한 제한이 없이 높은 시간분해능으로 결합 형성 순간을 연구할 수 있다. 레이저에 의한 분자의 여기 이후 금 원자 사이의 거리를 실시간으로 추적한 결과, 500펨토초 이내에 금 원자 사이의 화학 결합이 형성되는 것이 밝혀졌고, 동시에 굽은 형태에서 선형으로 구조 변화가 진행되는 것으로 밝혀졌다. 그 이후에도 결합 거리가 더욱 짧아지는 과정, 외부의 금 단량체가 들어오면서 사합체가 만들어지는 과정들도 관측할 수 있었다. 한편, 선형으로 편광된 레이저 펄스를 실험에 이용할 때에는 들뜬 분자들의 배향이 일시적으로 비등방성을 갖게 되는데, 배열의 비등방성이 사라지는 것을 시간에 따라 추적하여 분자의 rotational dephasing의 과정이 얼마나 빠르게 일어나는지도 알아낼 수 있었다.
용액상의 산란 신호는 분자들의 등방성 배열 때문에 X-선 결정학과 비교했을 때, 많은 정보를 잃게 된다. 선형으로 편광된 레이저 펄스를 사용하게 되면 일시적으로 들뜬 분자의 배향이 비등방성을 갖게 되고, 레이저의 편광 방향을 달리 하면 서로 다른 산란 신호를 얻을 수 있기 때문에 정보량을 늘릴 수 있게 되는데, 이렇게 얻어진 실험 데이터를 해석하기 위해서는 분자의 비등방성 배열에서 예측되는 이론적 산란 신호를 계산할 수 있어야 한다. 더욱이 실험의 시간분해능이 피코초 이하로 향상됨에 따라서 불가피하게 비등방성의 신호가 실험에서 관측되기 때문에 이를 해석하기 위한 이론적 연구가 필수적이다. 이를 위해 비등방성 배열에서 나오는 산란 신호를 계산하기 위한 수식을 유도하였고, 서로 다른 편광 방향에 대해서 계산된 이론적 산란 신호를 이용하여 얼마나 정보량이 증가할 수 있는지에 대해 알아보았다.
