Gold is very stable in biochemical environments and can immobilize easily bioactive molecules including DNAs, aptamers, antibodies, and peptides through Au-S bonding. In addition, gold is an excellent plasmonic material and has been widely used for fabrication of sensitive sensors. However, intrinsic surface defects of gold, such as step, terrace, vacancy, and grain boundary, are major problems for uniform immobilization of the biochemical molecules. Top-down polishing including thermal annealing, UV-ozone cleaning, and hydroxyl radical etching has been employed to reduce the surface defects, but being hardly possible to eliminate them completely. On the other hand, Au nanoplates synthesized in vapor phase have atomically smooth surfaces without any surface defects. Atomically flat surfaces of single-crystalline Au nanoplates can maximize the functionality of biomolecules, thus realizing extremely high-performance biosensors. Here, this paper reports both highly specific and supersensitive detection of C-reactive protein (CRP) and anti-cyclic citrullinated peptides (anti-CCP) by employing atomically flat Au nanoplates. Therefore, this thesis is organized as follows. Chapter 1 demonstrates Synthesis of two dimensional single crystalline Au nanostructures for applications of biosensors. Chapter 2 reports ultrasensitive CRP detection method employing Au nanoplate and protein G. Chapter 3 reports ultrasensitive anti-CCP detection method employing Au nanoplate and cyclic citrullinated peptides (CCP).
In chapter 1, we demonstrate synthesis of single crystalline Au nanoplates using CVD method, and report surface roughness measurements with atomic force microscopy (AFM).
In chapter 2, we report super-sensitive detection for CRP employing an ultraclean and attomically flat Au nanoplate. CRP is a protein biomarker for inflammation and infection and can be used as a predictive or prognostic marker for various cardiovascular diseases. To maximize the binding capacity for CRP, we optimized the Au nanoplate-Cys3-protein G-anti-CRP structure by observing atomic force microscopy (AFM) images. The optimally anti-CRP-immobilized Au nanoplates allowed extremely specific detection of CRP at the attomolar level. To confirm the binding of CRP onto the Au nanoplate, we assembled Au nanoparticles (NPs) onto the CRP-captured Au nanoplate by a sandwich immunoreaction and obtained surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra and scanning electron microscopy (SEM) images. Both the SERS and SEM results showed that we completely eliminated the nonspecific binding of Au NPs onto the optimally anti-CRP-immobilized Au nanoplate. Compared with the anti-CRP-immobilized rough Au film and the randomly anti-CRP-attached Au nanoplate, the optimally anti-CRP-immobilized Au nanoplate provided a highly improved detection limit of 10-17 M.
In chapter 3, we report super-sensitive detection for anti-CCP employing an ultraclean and atomically flat Au nanoplate. Recently, it has been reported that a small amount of anti-CCPs exists at early-stage of the rheumatoid arthritis (RA). So, ultrasensitive sensor to detect them has been quite desirable for early-diagnosis of RA. Here, we produced a highly sensitive SERS sensor against anti-CCPs employing ultraflat, ultraclean single-crystalline Au nanoplates. Interestingly, the atomically flat Au nanoplates without surface defects can immobilize thiolated CCPs and blocking molecules uniformly and reduce the non-specific bindings as 50 times compared with a commercial Au film. Therefore, the Au Particle-on-Plate SERS platform employing the Au nanoplates can analyze anti-CCPs quantitatively with 4×10-17 M (40aM) of detection limit.
In chapter 4, we report the bioaccumulation of nanoplastics and their effect on the toxicity of a metal ion individually and in combination, using polystyrene (PS) nanoplastics and Au ions as representative model materials, respectively, in zebrafish embryos (ZFEs). We demonstrated that PS nanoplastics induced only marginal alterations in the survival, hatching rate, developmental abnormality, and cell death of ZFEs but that these effects became synergistically exacerbated in a size- and dose-dependent manner when the PS nanoplastics were concomitant with the Au ion. Such exacerbation of toxicity was correlated with the oxidative stress and pro-inflammatory responses synergized by the presence of PS, which induced mitochondrial damages at the subcellular level. Taken together, we propose a role of PS mainly as a potential risk factor for environments and organisms.
금은 생화학 환경에서 아주 안정하고, Au-S 결합을 통해 DNA, 압타머, 항체, 그리고 펩타이드를 포함한 생활성 분자들을 쉽게 고정시킬 수 있습니다. 또한 금은 뛰어난 플라즈모닉 물질로, 민감한 센서를 제작하는데 폭넓게 이용되어 왔습니다. 하지만, step, terrace, vacancy, 그리고 grain boundary와 같은 금의 본질적인 표면 결함들은 생화학 분자들의 균일한 고정을 위한 중요한 문제들입니다. thermal annealing, UV-ozone cleaning, 그리고 hydroxyl radical etching를 포함한 top-down polishing이 표면 결함들을 줄이기 위해 활용되어 왔으나, 그들을 완전히 제거할 수 없습니다. 반면에, 기상에서 합성된 금 나노판은 결함 없이 원자 수준으로 매끄럽고, 결 맞게 연결된 금속-분자 인터페이스를 만들 수 있습니다. 원자적수준으로 평평한 단결정 금나노판은 생분자의 기능을 최대화 하여, 매우 고성능의 바이오 센서를 구현합니다. 이 논문에서는 원자적으로 평평한 Au nanoplate를 이용하여 C-reactuve protein(CRP) 와 anti-cyclic citrullinated peptides(anti-CCP)의 고특이적 및 초고감도 검출을 보고합니다. 따라서 이 학위 논문은 다음과 같은 구성으로 되어 있습니다. 제 1장은 2차원 단결정 금 나노구조의 합성 방법 및 바이오센서로서의 응용에 대해 설명합니다. 제 2장에서는 금 나노판과 protein G를 이용한 초고감도, 고선택적 CRP 검출 방법에 대해 보고합니다. 제 3장에서는 금 나노판과 anti-cyclic citrullinated peptides(CCP)를 이용한 초고감도, 고선택적 anti-CCP 검출 방법에 대해 보고합니다.
제 1장에서는 CVD 방법을 이용하여 단결정 금 나노 구조를 합성하는 방법에 대한 설명과, atomic force microscopy(AFM) 를 통한 표면의 거칠기 측정에 대해 보고합니다.
제 2장에서는 매우 깨끗하고 원자 수준으로 편평한 금 나노판을 이용하여 매우 민감하게 CRP를 검출하는 방법에 대해 보고 합니다. CRP는 염증 및 감염에 대한 단백질 바이오마커 이며 다양한 심 혈관 질환의 예측 또는 예후 지표로 사용 할 수 있습니다. CRP의 결합 능력을 극대화하기 위해 우리는 AFM 이미지를 관찰하여 금 나노판- Cys3-proein G-anti-CRP 구조를 최적화 했습니다. 최적으로 금 나노판에 고정된 anti-CRP는 CRP의 attomolar수준으로 초고감도 검출할 수 있었습시다. 금 나노판에 CRP의 결합을 확인하기 위해, 우리는 샌드위치 면역반응에 의해 CRP가 포획된 금 나노판 위에 금 나노입자 (NPs)를 조립하고 surface-enhanced Raman scattering (SERS) 스팩트럼 및 scanning electron microscopy (SEM)의 이미지를 얻었습니다. SERS 및 SEM 결과 모두 최적의 anti-CRP가 고정된 금 나노판에서 금 나노입자의 비특이적 결합을 완전히 제거한 것으로 나타났습니다. Anti-CRP가 고정된 거친 금 필름과 무작위로 anti-CRP가 부착된 금 나노판과 비교할 때, 최적으로 anti-CRP가 고정된 금 나노판은 10-17 M의 매우 향상된 검출 한계를 제공 하였습니다.
제 3장에서는 매우 깨끗하고 원자수준으로 편평한 금 나노판을 이용하여 매우 민감하게 anti-CCP를 검출하는 방법에 대해 보고 합니다. 최근에 류마티스 관절염의 초기에 소량의 anti-CCPs 존재한다는 것이 보고되고 있습니다. 그래서, 그들을 검출하기 위한 초고감도 센서는 류마티스 관절염의 조기진단을 위한 상당한 가치를 가집니다. 우리는 아주 매끈하고 깨끗한 단결정 금 나노판을 이용하여 anti-CCP에 대해 대단히 민감한 SERS 센서를 제작하였습니다. 흥미롭게도, 표면결함 없이 원자수준으로 매끈한 금 나노판은 thiolated CCPs 와 blocking 분자들을 표면 위에 아주 균일하게 고정시키고 시판되는 금 박막에 비해 비특이적인 결합을 50 배 정도 줄일 수 있다. Therefore, 금 나노판을 이용한 Particle-on-Plate SERS 플랫폼은 4X10-17 M의 검출 한계로 anti-CCP를 정량분석 할 수 있었습니다.
제 4장에서는 제브라피쉬(ZEF) 에서 나노 플라스틱의 생물 축적 및 금속 이온의 독성에 대한 영향을 대표적인 모델 물질로서 각각 polystryene(PS) 나노 플라스틱 및 금 이온을 사용하여 개별적으로, 그리고 조합하여 측정 하였습니다. PS 나노 플라스틱이 ZFE의 생존율, 부화율, 발달 이상 및 세포 사멸의 매우 미세한 변화만을 유도했음을 보여 주었지만, PS 나노 플라스틱이 금 이온과 결합 할 때 크기 및 용량 의존적으로 독성의 상호 상승 작용을 일으킨 것을 확인 하였습니다. 이러한 독성의 증가는 세포 내 수준에서 미토콘드리아 손상을 유도 한 PS의 반응에 의해 상승 작용하는 산화 스트레스 및 염증 반응과 상관 관계가 있었습니다. 이러한 결과를 통해 PS가 환경과 유기체의 잠재적 인 위험 요인으로 작용할 수 있음을 제안합니다.
