For the last decade, a number of therapeutic proteins have been developed and are now widely used in the clinic. They possess the broad spectrum starting from peptides, antibodies, cytokines, and hormones. A part from antibodies, most of these therapeutic proteins tend to have small molecular weight. Due to their small size, these therapeutic proteins result in fast clearance when injected into body and therefore show low therapeutic efficacy. This is because they undergo renal clearance by having molecular weight smaller than the renal filtration threshold, which is 60 kDa. As a result, their short half-life is considered as a critical drawback in the development of therapeutic agents.
Small-sized non-antibody scaffolds have also attracted considerable interest as alternatives to immunoglobulin antibodies. However, their short half-life is considered as a drawback in the development of therapeutic agents. We have demonstrated that a homo-dimeric form of a repebody enhances the anti-tumor activity than a monomeric form through prolonged blood circulation. Spytag and spycatcher were genetically fused to the C-terminus of a respective human IL-6-specific repebody, and the resulting two repebody constructs were mixed at an equimolar ratio to produce a homo-dimeric form through interaction between spytag and spycatcher. The homo-dimeric repebody was detected as a single band in the SDS-PAGE analysis with an expected molecular size (78 kDa), showing high stability and homogeneity. The dimeric repebody was shown to simultaneously accommodate two hIL-6 molecules, and its binding affinity for hIL-6 was estimated to be comparable to a monomeric repebody. The serum concentration of the dimeric repebody was observed to be about 5.5 times higher than a monomeric repebody, consequently leading to considerably higher tumor suppression effect in human tumor xenograft mice. The present approach can be effectively used for prolonging the blood half-life of small-sized protein binders, resulting in enhanced therapeutic efficacy.
Recombinant protein drugs derived from endogenous proteins show promising effects in variety of diseases. However, since most of these recombinant therapeutic proteins tend to have small molecular weight, they are likely to undergo fast clearance within several minutes when injected. We have demonstrated that a human serum albumin-specific repebody significantly prolong the blood circulation time of small-sized protein drugs and as a result enhance their therapeutic efficacy. Repebody that specifically binds with human serum albumin was selected through phage display. After one round of affinity maturation, the binding affinity was measured as 4.3 nM through surface plasmon resonance (SPR). The developed HSA-specific repebody showed high binding stability and enhanced pharmacokinetics profile. The terminal half-life was 6.7 h and area under curve value was 12.3-fold higher compared to off-target repebody. Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) with DPP-VI resistance was genetically fused to the C-terminus of an HSA-specific repebody as a proof of our platform. The repebody-fused GLP-1 was expressed in E. coli with high purity and yield, confirmed by size exclusion chromatography and SDS-PAGE analysis. The GLP-1 fused with HSA-specific repebody showed prolonged blood circulation profile compared fusion with off-target repebody resulting in a terminal half-life of 10.2 h and 4.2-fold increase of area under curve value. As a result, the HSA-specific repebody-fused GLP-1 significantly enhanced control over blood glucose level in both normal and type 2 diabetes model mice compared to both wild type and off-target repebody-fused GLP-1. This HSA-specific repebody based therapeutic protein delivery platform can be effectively and generally used for prolonging the blood half-life of various small-sized protein therapeutics, and hence result in enhanced therapeutic efficacy.
In this thesis, we will demonstrate various engineering strategies to elongate the blood circulation time of these small-sized therapeutic proteins, especially by utilizing protein dimerization and human serum albumin. The proposed strategies can be generally used for the elongation of blood circulation time of small-sized therapeutic proteins, and hence result in enhanced therapeutic efficacy.
지난 10여 년간 많은 단백질 치료제들이 개발되었고 이로 인하여 현재 임상에서 매우 활발하게 질병 치료의 일선에서 사용되고 있다. 이들은 펩타이드부터 항체, 사이토카인, 그리고 호르몬에 이르기까지 매우 다양한 분포도를 가지고 있다. 하지만 항체를 제외한 이들 대부분의 단백질 치료제들은 작은 분자량을 가지고 있다. 따라서 체내에 주입 시 혈액 내에서 빠르게 소진되는 경향을 보이고 결국 이는 치료 효과가 낮아지는 결과로 이어지게 된다. 이러한 원인은 분자량이 신장의 여과 기준인 60 kDa보다 작기 때문에 대부분이 신장에서 걸려져 체외로 제거되기 때문이다. 그 결과, 작은 분자량을 갖는 단백질 치료제들의 짧은 혈액 내 순환 시간은 치료제 개발에 있어서 가장 치명적인 단점으로 여겨지고 있다.
작은 크기의 비항체-골격 단백질 또한 항체를 대체할 물질로서 많은 각광을 받고 있다. 그러나 이들의 짧은 혈액 내 반감기는 아직까지도 크나큰 단점으로 작용하고 있다. 이러한 단점을 극복하고자 비항체 골격 단백질인 리피바디의 이합체 형태를 개발하였고 이를 통해 혈액 내 순환 시간이 개선되고 궁극적으로는 암 세포 억제 능력이 향상되었음을 확인하였다. Spytag과 spycatcher 단백질이 유전공학적으로 인간 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 리피바디의 C 말단에 연결하였고, 이렇게 만들어진 2개의 리피바디 융합 단백질을 동일한 몰 농도로 혼합한 결과 spytag과 spycatcher 단백질의 결합을 통해 리피바디 동종이합체를 만들었다. 이렇게 만들어진 리피바디 동종이합체는 SDS-PAGE 분석에서 예상된 사이즈(78 kDa)를 나타내는 한 개의 띠로 관찰되었고, 매우 높은 안정성과 균질성을 보였다. 또한, 2개의 인간 인터루킨-6 분자와 동시에 결합할 수 있었고 그 결합력은 리피바디 단일 분자와 유사한 수준을 유지하고 있었다. 쥐 실험을 통해 혈장 농도가 리피바디 단일 분자보다 5.5배 높음을 확인하였고, 그 결과 이는 향상된 암 억제효과로 이어졌다. 이 방법은 저분자 비항체 골격 단백질들의 혈액 내 순환 시간을 늘려주고 그 결과 치료 효능도 높여주는 매우 효율적인 방법으로 적용될 수 있을 것이라 판단된다.
자연적으로 존재하는 내생의 단백질로부터 유래된 다양한 재조합 단백질 치료제들은 여러가지 질병에서 획기적인 치료 효능을 나타내고 있다. 하지만 이들 대부분의 재조합 단백질 치료제들은 작은 분자량을 가지는 경향이 많은 데, 이로 인하여 체내에 주입 시 수분 내에 매우 빠르게 소모되는 특성을 보인다. 이러한 특성을 보완하고자 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 리피바디를 개발하였고, 이를 이용하여 저분자 단백질 치료제의 혈액 내 순환시간이 획기적으로 증가됨과 동시에 치료효과 또한 매우 향상되는 것을 확인하였다. 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 리피바디는 파지 디스플레이 방법을 이용하여 선별되었다. 결합력 증대 과정을 통한 결과, 4.3 nM의 결합력을 가짐을 표면 플라스몬 공명 장치를 이용해 측정되었다. 개발된 인간 혈장 알부민 특이적인 리피바디는 높은 안정성과 획기적으로 증가된 약물동태학적 특성을 보였다. 종단 반감기는 6.7 시간으로 측정되었고 곡선하면적은 대조군에 비하여 12.3배 증가한 것으로 나타났다. 저분자 단백질 치료제의 모델로서 글루카곤 유사 펩타이드-1 (GLP-1)이 사용되었다. DPP-IV 펩티다아제에 대한 저항성을 가지는 GLP-1을 인간 혈장 알부민 특이적인 리피바디의 C 말단에 유전공학적으로 연결하였다. 이렇게 만들어진 융합 단백질을 대장균에서 발현한 결과 매우 높은 순도와 수득률을 가짐을 크기 배제 크로마토그래피와 SDS-PAGE 분석을 통해 확인되었다. 기존의 GLP-1은 혈액 내에서 약 2분의 반감기를 가지는 데 반해, 인간 혈장 알부민 특이적인 리피바디에 연결된 GLP-1은 종단 반감기가 10.2 시간으로 증가하였고 곡면하면적이 4.2배 증가한 것으로 나타났다. 그 결과, 인간 혈장 알부민 특이적 리피바디에 결합된 GLP-1은 보통 쥐와 제2형 당뇨병 모델 쥐에서 매우 향상된 혈당량 조절능력을 보였다. 따라서, 개발된 인간 혈장 알부민 특이적 리피바디 기반의 단백질 치료제 전달 플랫폼은 매우 효율적으로 그리고 광범위하게 혈액 내 순환 시간을 늘리고 치료 효능을 높이는 용도로 사용될 수 있을 것으로 보인다.
본 학위논문에서는 이러한 저 분자 단백질 치료제들의 혈액 내 순환 시간을 늘리는 공학적 방법에 대해 고찰하는데, 특히 이합체화, 인간 혈장 알부민을 이용한 방법에 대해 다루고자 한다.
