Capicua (CIC) acts as a transcriptional repressor in fly and mammals and it is conserved from C.elegans to human. Previous research shows that its function is also conserved as regulator of downstream genes of the RTK (Receptor Tyrosine Kinase) signaling pathway. CIC represses tll, hkb and zen which is related to dorsoventral patterning and development of terminal region in fly and ETV1, 4 and 5 in mammal. It is known that CIC recognizes the octameric target site, TGAATGAA at the promoter region of target genes through the DNA binding region, the HMG-box domain. CIC is related to generation of several diseases including one of the polyQ diseases, spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), and several cancers. Somatic mutations found in the HMG-box DNA binding domain in CIC have been implicated with several cancers such as oligodendroglioma, oligoastrocytoma, and adenocarcinoma. Especially, the majority of patients with oligodendroglioma possesses mutations in CIC and the number of mutations were identified in the HMG-box domain. However, the molecular basis of the DNA binding of CIC and the effect of the somatic mutations found in cancers on DNA binding have not been investigated. Here, we report the crystal structure of the HMG-box domain of CIC complexed with its target DNA, the promoter of Ets Translocation Variant 5 (ETV5). The crystal structure was solved at $3.0\angstrom\$ in space group P32. The structure shows that the HMG-box domain posits a roughly L-shaped structure and recognizes the minor groove leading to DNA bending. We examined the interactions between HMG-box domain and ETV5-DNA observed in crystal structure in solution by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Also, our structure combined with result of EMSA revealed that mutations in the HMG-box domain found in the cancers abrogate the interaction with DNA. These results provide the molecular insight into the DNA binding of CIC and the effect of carcinogenic mutations on the DNA binding.
카피큐아 (CIC) 는 초파리와 동물세포에서 전사억제인자로 작용을 하고 그 서열이 예쁜꼬마선충부터 인간 종에까지 보존되어있다. 앞선 연구에서 카피큐아는 수용체 타이로신 인산화효소 (RTK) 시그널링의 영향을 받는 하위 유전자들의 전사를 조절한다는 것이 알려져있다. 초파리에서는 등배축 형성, 말단 부위 발생에 관여하는 유전자들인, tll, hkb 그리고 zen 의 전사를 조절하고 사람세포에서는 ETV 1,4 그리고 5 의 전사를 조절한다는 것이 밝혀져있다. 카피큐아는 내부에 존재하는 HMG 박스 도메인을 이용해 목표 유전자의 프로모터 (promoter) 부위에 존재하는 타겟 서열, TGAATGAA, 을 인식하여 DNA 와 결합한다. 카피큐아는 폴리 글루타민병의 일종인 척추소뇌성 운동실조증 타입1 과 여러 종류의 암의 발병에 관련이 되어있다. 희돌기교종 (oligodendroglioma), 핍지교성상세포종 (oligoastrocytoma) 그리고 선암 (adenocarcinoma) 환자에서는 HMG 박스 도메인에 체세포 돌연변이가 발견되었는데, 특히 희돌기교종 환자의 경우 많은 비율로 카피큐아에서 돌연변이가 확인되었고, 대부분 HMG 박스 도메인에서 발견되었다. 그러나 HMG 박스 도메인이 타겟 서열과 바인딩하는 분자적 메커니즘과 암세포에서 발견된 돌연변이가 HMG 박스 도메인의 DNA 바인딩에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 없다. 우리는 HMG 박스 도메인의 DNA 바인딩 기작과 암 유래 돌연변이의 역할을 밝히기 위해 CIC 의 HMG 박스 도메인과 타겟 유전자 중 하나인 ETV5-DNA 의 프로모터 서열 복합체의 구조를 규명하였다. 그 결과로, P32 공간군을 가지는 3.0 Å 해상도의 3차원 원자 구조를 얻었다. HMG 박스 도메인은 세개의 알파 나선이 전반적인 L자 모양을 이루었으며 DNA 의 소홈 (minor groove) 와 상호작용하여 DNA 의 구부러짐을 유발하였다. 수용액 상에서의 분자간 상호작용을 알아보기 위한 EMSA 실험을 통해 구조에서 관측된 단백질 잔기-DNA 분자 사이의 상호작용이 실제 수용액 상에서도 관측됨을 보였다. 또한 암에서 발견된 몇 개의 돌연변이는 HMG 와 타겟 DNA 사이의 상호작용을 저해한다는 것을 알았다. 이 실험 결과를 통해 DNA 바인딩의 분자적 기작과 암에서 발견된 돌연변이의 발암 과정에서의 역할을 제시하였다.
