Platelets, or thrombocytes, are anucleated tiny blood cells and have an indispensable role in hemostatic properties of whole blood by detecting injured sites at the surface of blood vessels and forming blood clots. In particular, in the routine surgical operations, a lack of or functional loss of platelets may lead to excessive bleeding in a patient and, in contrast, excessive activation of platelets can cause an embolism. Therefore, there has been a great demand for a technique capable of quickly and objectively measuring the platelet functionalities. The most direct method for examining the platelet function is to observe the activability of the platelets, and each platelet undergoes a large morphological alteration such as the exocytosis of intraplatelet granules or formation of pseudopods at the surface during the activation process. However, due to the small size of the platelets and the irregularity of its shape, most current clinical tests mainly focus on the observation of the macroscopic aggregations among platelets, rather than the activation of individual platelets. Accordingly, imaging-based platelet studies still remain at the basic level, and, in particular, the optical observation of the whole activation process of platelets at the individual cell level has not been thoroughly investigated yet.
In this thesis, we quantitatively and non-invasively investigate the morphological and biochemical alterations of individual platelets in its activation process without using any exogenous agent by employing 3-D quantitative phase imaging (QPI) technique which can reconstruct 3-D refractive index (RI) tomograms of microscopic cells. In the first chapter of this thesis, we briefly deal with the overall morphology and intraplatelet structure of platelets and the internal mechanism of platelet activation. In the following chapter, we introduce general principles of QPI. In the third chapter, we address the changes in various characteristics of platelets depending on the extent of platelet activation by optically measuring individual platelets before and after administration of platelet agonists. Here, collagen, thrombin, and thrombin receptor activating peptides are used to selectively stimulate the activation signalling routes of platelets. In the fourth chapter, we introduce a modified QPI setup for high-speed and long-time measurements of platelet tomogram. Then, resting platelets in the plasma are activated using thrombin, and 3-D RI tomograms of the corresponding platelets are simultaneously measured at both long and short time-scales to access the continuous morphological and biochemical alterations of individual platelets under activation. In Chapter 5, in the extension of the concerns about utilization of the holographic imaging system for a clinical platelet study, we quantitatively address how the morphological and intraplatelet properties of the stored platelets change with the storage period and method. Finally, in the last chapter, we summarize the contents covered in this thesis as a whole, and present a future research direction that QPI should go ahead in order to be widely utilized in the clinical field in the future.
혈소판은 포유동물의 피 속에 존재하는 작은 혈세포로, 손상된 혈관의 위치를 특정하고 해당 위치에서 활성화되어 혈전을 생성하는 등 생체 내부의 지혈작용에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 특히 일상적인 외과적 수술과정에서 혈소판의 부족 및 성능저하는 환자의 과다출혈을 유발하고, 반대로 혈소판의 과다활성은 색전증을 일으키므로, 혈소판의 성능을 빠르고 객관적으로 측정할 수 있는 기술에 대한 요구는 계속해서 존재해왔다. 혈소판의 성능을 검사하는 가장 직접적인 방법 중 하나는 혈소판의 활성화 가능 여부를 판별하는 것으로, 개별 혈소판은 활성화과정을 거치면서 세포 내의 과립세포를 외부로 유출하거나 위족이 생성되는 등의 큰 형태변화를 겪게 된다. 하지만 혈소판의 매우 작은 크기와 그 형태의 비정형성으로 말미암아, 현재 임상적으로 시행되는 대부분의 검사는 개별 혈소판의 활성화가 아닌 혈소판들 사이의 거시적 응집현상의 관찰에 초점을 맞추고 있다. 이러한 과정에서, 이미징 기술에 기반한 개별 혈소판의 활성화에 대한 연구는 여전히 기초적인 단계에 머물러 있으며 개별세포 단위에서의 혈소판의 활성화과정에 대한 광학적 관찰은 아직까지도 자세히 연구된 바가 없다.
본 학위 논문에서는, 혈소판이 유발하는 빛의 위상지연을 정량적으로 측정가능하고 나아가 혈소판의 3차원 굴절률 분포를 재구성할 수 있는 기술인 3차원 정량적 위상 이미징 기술을 이용하여, 개별 혈소판의 활성화 과정에서 일어나는 여러 생물리적 변화에 대한 연구를 세포 외인성 표지의 사용없이 비침습적인 방법을 이용하여 수행하였다. 논문의 가장 앞 부분에서는 혈소판의 형태 및 구조 그리고 활성화의 내부 메커니즘에 대한 전반적 내용을 다루며, 이어지는 챕터에서 개별 혈소판의 광학 측정에 사용될 기술인 정량적 위상 이미징 기술의 원리에 대해 소개한다. 세 번째 챕터에서는 콜라겐, 트롬빈, 그리고 트랩과 같은 혈소판 작용제를 사용하여 혈소판의 활성화 체계를 선택적으로 자극하고, 활성화 전후의 혈소판 그룹에 대한 광학측정 결과를 토대로 혈소판의 활성화 정도에 따른 여러 물성의 변화에 대해 연구하였다. 이어 네 번째 챕터에서, 보다 빠르고 긴 시간동안 광학 측정이 가능한 위상 이미징 셋업을 구성하여 개별 혈소판이 활성화되는 과정을 다양한 타임스케일에서 연속적으로 관찰하는데 성공하였다. 다섯번째 챕터에서는 홀로그래픽 이미징 기술의 혈소판 관련 임상연구 활용 방안의 연장선에서, 성분채집된 혈소판의 보관기간과 보관방법에 따른 혈소판의 형태적 그리고 생물리적 특성의 변화과정을 관찰하였으며 직접적 활성화의 경우와 비교 연구를 수행하였다. 마지막 챕터에서는 본 논문에서 다룬 내용을 전체적으로 요약하고 나아가 정량적 위상 이미징이 앞으로 임상분야에서 활용되기 위해 나아가야 할 연구 방향을 제시한다.
