The selective enrichment of circulating tumor markers is required for estimating the metastatic relapse and tumor burden of cancer patients. However, the isolation of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor exosomes (CTExs) are still challenging due to their own issues. This dissertation presents dual-patterned immunofiltration (DIF) devices applicable for marker-specific enrichment with negative and positive strategy. The DIF device is designed not only to maximize the binding rate but also minimize the loss rate, by enhancing flow whirling, resulting in effective isolation in terms of high-throughput and high enrichment ratio.
In the first chapter, the DIF device is modified with anti-CD45 antibodies for negative enrichment of CTCs, thus resolving rarity and heterogeneity (NS-CTC-DIF). The device eliminated 97.07 ± 2.79 % of leukocytes, with the loss of less than 10% loss of cancerous cells; consequently, the untouched CTCs were thoroughly enriched 23,188 times by 1-hour process. The device was further verified using the blood samples from 11 cancer patients, and average 283.3 CTC-like cells were identified with heterogeneous characteristics. Those cells which are isolated by the devices included relatively small cells (<15 um), EpCAM-negative cancer cells and triangular cells having multi-vacuolation. Meanwhile, less than 1 CTC-like cells were found in the samples from healthy donors. These results implies that most CTC-like cells can be lost under the approach focused on specific characteristics.
In the second chapter, the DIF device is modified with anti-CD63 antibodies through cleavable linker for positive enrichment of circulating exosomes, thus resolving low purity and high variety (PS-CTX-DIF). The device isolated approximately 16.0 % higher amount of MCF-7 secreted exosomes, compared to the conventional exosome isolation kit; accordingly, the captured exosomes were subsequently released via reduction of cleavable linkers. The device was further verified using plasma samples from 6 cancer patients and 4 healthy donors. The cancer patients showed 2.7 times higher concentration of exosome-sized vesicles, compared to healthy donors. In spite of deviation among cases, the gap in enrichment yield between cancer patients (4.00) and healthy donors (0.80) are clearly distinguishable. These results implies that increment of exosome level might be related to the disease.
In conclusion, the present DIF devices shows rapid and effective immunofiltration performance for the circulating markers. On the basis of the enhanced binding rate and reduced loss rate, heterogeneous CTCs and CTExs were efficiently enriched within a short time. Therefore, the flexible strategy combined with NS-CTC-DIF and PS-CTX-DIF devices is capable to the effective collection of highly purified circulating markers for the downstream analysis, making possible to understand the unknown properties or undiscovered roles of circulating tumor markers.
혈중암세포와 혈중엑소좀 등의 혈중순환종양마커는 액상 생검의 주요 분석 대상으로 주목받고 있지만 그 검출에 있어 제약이 되는 고유의 이슈를 갖고 있다. 따라서 항원-항체간의 반응 효율을 극대화하면서 각각의 이슈에 따라 전략적으로 유연하게 대처할 수 있는 방법이 요구된다. 본 논문에서는 유체의 미세 교반을 유도하는 양면패턴면역필터의 고유한 구조적 디자인과 균일하고 안정적이며 비특이적 흡착을 방지하는 항체 고정화의 분자적 디자인을 통해 반응률을 최대화하고 손실률은 최소화하는 양면패턴면역필터를 제안하고, 이에 바탕하여 양성 혹은 음성 선별 전략을 선택적으로 구현함으로써 혈중암세포의 희귀성과 이종성, 혈중엑소좀의 낮은 순도와 높은 분산도를 각각 해결하고자 하였다. 첫번째 챕터에서는 백혈구 특이항체를 접목한 양면패턴면역필터(NS-CTC-DIF)로 혈중암세포를 음성 선별하여 97.07 ± 2.79 %의 백혈구를 제거하는 동안 10 % 미만의 암세포 손실이 가능함을 증명하였고 이때 1시간 과정을 통해 23,188배 농축률 향상을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 4종 11건 암환자 시료에 적용하여 다양한 표면 마커 특성과 다양한 크기를 지닌 혈중암세포를 발견하여 단일 특성에 의존한 기존 선별 방법의 위험성을 암시하는 결과를 얻었다. 두번째 챕터에서는 혈중엑소좀 특이항체와 분리 가능한 링커 분자를 접목한 양면패턴면역필터(PS-CTX-DIF)로 혈중엑소좀을 양성 선별하여 기존 상용키트 대비 18.2% 많은 엑소좀 크기 입자를 2.5시간 이내에 농축하여 회수하였다. 이러한 결과를 바탕으로 2종 6건 암환자 시료에 적용하여 정상인 대비 2.7배 많은 엑소좀이 존재함을 확인하였고 농축률에 있어 암환자 시료와 정상인 시료 사이에는 약 5배의 차이가 있음을 확인하였다. 또한 선별된 엑소좀의 암 특이 마커 발현량에 있어서도 큰 차이가 있음을 증명하여 암 등의 질병과 엑소좀 농도 증가의 연관성을 의심할 근거를 제시하였다. 상기 결과는 혈중암세포와 혈중엑소좀의 고유한 문제를 항체 기반의 단일 플랫폼으로 효과적으로 해결하는 동시에 선택적 선별 전략의 적용으로 조합 혹은 확장이 가능한 것으로 동일 환자 시료의 비편향적 다중분석은 물론 추가 분석 등 후속 연구로의 연결 가능성을 높였다는 점에서혈중순환종양마커들의 임상적 의미 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.
