Artificial protein assemblies require a method to conjugate two or more proteins in a stable and predictable structure. “Shared helix method” is useful for protein engineering that fuses the exposed alpha helices from two different protein components rigidly and predictably. In this study, the successful design of these novel fusion proteins, Putrescine aminotransferase (YgjG) complexes, was confirmed by X-ray crystallography. Also, we applied shared helix method to structural analysis of small target proteins (~<100kDa) using cryo-EM. To overcome size limitations in cryo-EM, we selected glutamate dehydrogenase (GDH) as a scaffold protein to determine the structure of small target proteins and the protein assemblies were successfully constructed using shared helix method. This application does not need to optimize the extra sequence of linker to connect each protein and forms stable complex conformation. Since, using the high molecule protein and small target protein complex, which was fused by alpha helix fusion method, is capable to assemble the cryo-EM and may improve to be convenient tool for cryo-EM analysis of small target protein.
인공적인 단백질 조합은 두개 이상의 단백질의 알파 핼릭스를 연결하는 융합 방법으로 단백질들이 안정적으로 이어져 그 구조가 예상 가능한 형태로 연결되는 것이 중요한 연구이다. 외부로 노출 된 두 알파 헬릭스를 추가적인 아미노산 없이 서로 공유하는 지역을 두고 융합하는 방법으로써 연결한 핼릭스가 단단하고 예상한 형태로 안정적으로 유지되는 것을 목표로 하고 있다. 본 연구에서는 Putrescine aminotransferase (YgjG) 복합체의 알파 핼릭스 퓨전 디자인을 결정화하여 엑스선 결정학으로 구조를 확인하는 것에 성공하였다. 또한 이러한 알파 핼릭스 퓨전 방법으로 작은 크기의 타겟 단백질 (~<100kDa) 의 극저온 전자현미경을 이용한 구조 분석에 적용할 수 있는 실험을 진행하였다. 극저온전자현미경을 이용한 구조 분석 연구에서 크기로 인한 한계를 극복하기 위해 Glutamate Dehydrogenase(GDH)를 스카폴드 프로테인으로 활용함으로써 관찰하고자 하는 작은 단백질과 성공적인 복합체를 형성할 수 있었다. 또한 이러한 응용법은 단백질들이 안정한 복합체를 형성하기 위해 필요한 추가 시퀀시를 더한 링커의 적합한 형태를 찾기 위한 별도의 과정이 필요 없기 때문에 작은 타겟 프로테인의 극저온전자현미경을 이용한 구조 분석에 유용하게 이용되어 편리한 응용법이 될 것이라고 생각한다.
