In an effort to develop a high cell density fermentation platform for L-tyrosine-overproduction in Escherichia coli, various process modifications were investigated in conjunction with screening of metabolically engineered construct in a bioreactor setting. Engineering biosynthetic pathway of aromatic amino acids has been challenging due to the complicated metabolic and regulatory network, where a transcriptional regulator TyrR plays a central role in the regulation of L-tyrosine biosynthesis affecting the gene expression of the nine genes involved in the biosynthesis of aromatic amino acids. Previous efforts on this project searched for key enzymes in L-tyrosine biosynthetic pathway by determining the effects of the combinatorial overexpression of the target enzymes on L-tyrosine production in relation to TyrR regulation. While many efforts have been made into understanding and engineering pathways for L-tyrosine production in Escherichia coli, few investigation have targeted bioprocess related influences on L-tyrosine production. Phosphate limitation was found to be disadvantageous to L-tyrosine production while feed-profile was found to be dependent on the various strains and their knockouts. Additionally, nutrient limitation, temperature, and shear stress were investigated as possible process modifications to enhance L-tyrosine production. Final bioreactor fed-batch fermentation of various constructs were able to produce up to 43.1 g/L L-tyrosine. The results from this study will provide valuable design principles for engineering the aromatic amino acid biosynthetic pathway.
본 연구에서는 대장균에서의 타이로신 고밀도 세포 발효 플랫폼을 구축하기 위해, 다양한 공정과정조절과 대사공학적 발효기 세팅 조절을 실행하였다. 지금껏 아로마틱 아미노산의 대사공학은 복잡한 대사회로로 인해 어려운 과제로 여겨져 왔었다. 타이로신의 대사회로 안에서는 전자조절인자인 TyrR이 L-타이로신 발현조절에 큰 역할을 하면서, 아로마틱 아미노산 합성과정에 포함되는 아홉 개의 유전자 발현에도 영향을 미친다. 이전 연구들은 L-타이로신 생산과 TyR 조절에 관여하는 중요 효소들의 과발현 실험을 통하여 L-타이로신 생산에 필요한 핵심 효소들을 밝혀내는 데에 집중하였다. 그러나 대사공학을 이용해 대장균에서 L-타이로신을 생산하는 연구는 많이 이루어진 데에 비해, 발효공정과정이 L-타이로신 생산량에 미치는 영향에 대한 연구는 진행된 바가 드물다. 본 연구에서는 인산염이 부족하면 L-타이로신 생산량이 감소하고, 영양소 부족, 온도, 그리고 shear stress 등의 물리적 요소들도 L-타이로신 생산에 영향을 미칠 수 있다는 것을 증명했다. 본 연구의 마지막 유가식 발효를 통해, 대장균으로부터 43.1g/L의 L-타이로신 생산에 성공하였다. 본 연구결과는 후에 대사공학을 통한 아로마틱 아미노산 생산 연구를 설계하는 데에 큰 기여를 할 것이다.
