Oleaginous microalgae of the Nannochloropsis genus are considered excellent candidates for biofuels and value-added products owing to their high biomass productivity and lipid content. Here, Nannochloropsis salina was successfully transformed with particle bomabardment, and the sfCherry fluorescent protein was overexpressed and visualized in N. salina for the first time. Genomic integration was confirmed by RESDA PCR ensuring stable expression of transgenes. We increased transformation efficiency by about 2-fold by using 30% conditioned medium. Using the developed transformation toolbox, NsbHLH2 transcription factor was overexpressed in N. salina, and the transformants showed enhanced growth under the normal and nitrogen limitation conditions. Analyses of NsbHLH2 expression with qRT-PCR revealed that NsbHLH2 may be involved in increased growth mainly under these conditions. The increased growth of NsbHLH2 transformants was linked to increased biomass and FAME productivities, particularly at day 8. However, growth of NsbHLH2 transformants became similar with WT possibly due to nutrient limitation at 12 day, so we conducted continuous cultivation allowing nutrient supplementation at various dilution rates. At high dilution rate ($D=0.5 day^{-1}$), biomass productivity of NsbHLH2 was 378 mg/L/d which was highest compared to WT. Subsequently, we induced maximum FAME productivity by N limitation at high dilution rate, resulting in 83.6 mg/L/d of FAME productivity. In order to understand how NsbHLH2 transformant grew better than WT, we carried out transcriptome analysis. Analyses of differentially expressed genes (DEGs) revealed that translational activity was greatly reduced in the transformant, which may be interpreted as enhanced stress responses. Instead of increased lipid accumulation by enhanced stress response, the transformant showed increased carbon fixation, metabolism of cellulose and acyl-CoA, which may contribute to the improved growth. Taken together, overexpression of NsbHLH2 in N. salina increased of biomass and lipid productivities under batch and continuous cultivation, which may apply to other industrial microalgae.
해산 미세조류인 나노클로롭시스는 높은 바이오매스와 지질생산성으로 바이오연료와 고부가가 가치 산물 생산을 위한 종으로 떠오르고 있다. 본 연구에서는 입자총법을 이용하여 처음으로 나노클로롭시스 살리나에 sfCherry 형광 단백질을 성공적으로 발현시켜 형광 단백질을 시각화시켰으며, RESDA PCR 기법을 이용하여 도입 유전자가 안정적으로 genomic DNA 에 삽입되는 것을 확인하였다. 또한 재사용 배지를 30% 섞은 항생제 배지를 이용하여 형질전환의 효율을 약 2배 증가시켰다. 이렇게 개발된 형질전환 기술을 이용하여 NsbHLH2 전사인자를 나노클로롭시스에 과발현시켰다. qRT-PCR을 통해 NsbHLH2 전사인자는 주로 세포 성장과 분할과 연관이 있음을 확인하였고, NsbHLH2 과발현 형질전환체가 더 빠른 성장속도를 보여, 결과적으로 배양 8일째의 바이오매스와 FAME 생산성을 증가시키는 효과를 가져왔다. 하지만 배양 12일째에 배지내의 영양소 고갈로 형질전환체와 나노클로롭시스 살리나 야생형의 건조중량이 비슷해지는 것을 확인하고 연속배양을 진행하여 NsbHLH2 과발현 형질전환체의 특성을 추가로 분석하였다. NsbHLH2 과발현 형질전환체의 바이오매스 생산량은 높은 희석률 ($D=0.5 day^{-1}$) 에서 378 mg/L/d 로 다른 희석률 조건과 비교하고 야생형과 비교했을 때 높은 수치를 보였다. FAME의 생산성을 증가시키기 위해서 높은 희석률 조건에서 질소원의 농도를 줄여 실험을 수행하였고 FAME 생산성을 83.6 mg/L/d 까지 시켰다. NsbHLH2 과발현 형질전환체의 증가된 성장에 대한 원인규명을 위해, 전사체 분석을 진행하였다. 배양 4일째의 차등발현유전자 분석자료를 고려해보면, 단백질 번역에 사용되는 리보좀 합성이 저해되면서 스트레스 저항성이 증가되는 것으로 보인다. 일반적으로는 스트레스 저항성의 증가가 지질 축적을 유도하지만, NsbHLH2 과발현 형절전환체의 경우에 탄소고정화 기능의 활성화, 세포벽을 만드는 데 필요한 셀룰로즈대사와 중성지방 합성, 그리고 에너지 대사에 관여하는 acyl-CoA의 대사가 증가하게 되면서 바이오매스와 FMAE 생산성이 함께 증가되는 것으로 분석된다. 본 학위논문의 연구를 통해 NsbHLH2 전사인자의 과발현이 나노클로롭시스 살리나의 바이오 연료생산에 기여할 것으로 기대하며, 다른 미세조류의 상업적 바이오연료 생산에도 적용할 수 있다.
