Microbial production of fatty acids and biodiesel from non-food renewable biomass has been attracting much attention. There have been several reports on microbial production of fatty acid ethyl ester (FAEE) biodiesel from glucose, but so far the titers have been rather low (<1.5 g/liter). This is mainly due to the tightly regulated fatty acid metabolism. On the other hand, the oleaginous bacterium Rhodococcus opacus PD630 is capable of accumulating triacylglycerols (TAGs) intracellularly up to 88 % of its dry cell weight. Here we report the high-level production of free fatty acids and biodiesel by metabolic engineering of R. opacus PD630. First, culture conditions, including pH, were optimized to produce $TAG^m$ to the highest concentration (119.2 g/liter) to date from glucose. For the production of free fatty acids, R. opacus ROP1 was developed by deleting six major fadD genes (encoding fatty acyl-CoA synthetase) and amplifying two native monoacylglycerol lipases (LPD01036 and LPD02672) under the acetamide-inducible promoter. Then, plasmid pROP1_34 harboring the native TAG lipase gene (LPD05381) without its signal sequence and Burkholderia cepacia lipase specific-foldase was introduced into the ROP1 strain. Fed-batch culture of the resulting strain produced 50.2 g/liter of free fatty acids from glucose, the highest level reported to date. For the production of FAEE, R. opacus ROP3_03 was developed by deleting seven major fadE genes (encoding acyl-CoA dehydrogenase), together with replacing the promoters of the most expressed fadD gene (LPD05217) and two native monogacylglycerol lipase genes with an acetamide-inducible promoter. Next, plasmid pROP3_03, which is pROP1_34 additionally harboring an aerobically active mutant aldehyde/alcohol dehydrogenase gene from Escherichia coli and a wax ester synthase gene from Marinobacterium hydrocarbonoclasticus with optimized RBS sequences, was introduced into the ROP3 strain. Fed-batch culture of the resulting ROP3_03 strain on glucose produced 21.3 g/liter of FAEEs. For the production of long-chain hydrocarbons (LCHC), pROPA1 harboring the genes encoding Clostridium kluyveri acyl-CoA reductase, codon-optimized Synechococcus elongatus acyl-ACP reductase and decarbonylase based on pROP1_34, was constructed. Fed-batch culture of ROPA2 strain (monooxygenase-deleted ROP3 strain) harboring pROPA1 on glucose produced 5.2 g/liter of LCHC. The metabolically engineered R. opacus strains developed here will be useful as platform strains for efficient production of fatty acids and their derivative chemicals and biofuels. In addition, for the extension of metabolic engineering tool in Rhodococcus species, we constructed modified sRNAs system in R. opacus PD630. Even though a basic component was similar to E. coli system, we tested several Hfq proteins to test binding scaffold and downregulation of proteins. By applying this system, we demonstrate enhanced chemical production in R. opacus PD630, showing its suitability for the development of biorefinery.
잠재된 원유의 고갈과 이에 따른 원유 가격의 지속적인 증가 추세, 그리고 원유 산업으로부터 발생되는 지구 온난화 등의 환경 문제가 매우 심각한 상황이다. 최근 급속도로 고갈되어가는 화석연료를 대체하고 심각해져가는 환경문제를 해결하면서 가파를 가격 상승을 하고 있는 원유를 대체할 수 있는 바이오 기반 신재생에너지의 생산에 대한 관심이 증가하고 있다. 원핵세포인 Rhodococcus 는 호기성의 그람양성균으로써 대부분의 종은 병원균이 아니며 토양, 물 및 진핵 세포를 포함한 넓은 범위의 환경에서 번식하고 있음이 밝혀져 있다. Rhodococcus 게놈은 약 9.25 Mb 이며 약 67% 의 G/C 를 포함하고 있다. Rhodococcus 속 종의 하나인 Rhodococcus opacus PD630 은 바이오디젤로의 화학적 변환이 가능한 트리아실글리세롤 (triacylglycerol) 이라는 지방을 자연적으로 생산하는 몇 안 되는 세균 중 하나이다. Rhodococcus opacus PD630 야생형을 질소원 제한적 환경에서 배양하였을 때, 건조 균체 당 약 80 % 이상 지질함유율이 관찰되었다. 트리아실글리세롤은 세 개의 지방산과 하나의 글리세롤로 이루어져있기 때문에 균 내에 트리아실글리세롤을 축적하는 특징을 이용하면 바이오연료의 전구체인 지방산을 다량 확보할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있기 때문에 미생물을 이용한 바이오 연료 생산 분야에 가장 적합한 미생물이라고 할 수 있겠다. 본 연구에서는 해당 미생물의 특징을 이용하여 다량의 TAG 를 균체 내에 축적할 수 있도록 한 후 이종 균주의 lipase 유전자를 도입하여 TAG 를 자유지방산으로 분해할 수 있도록 하였다. 또한 에탄올 생산 대사 경로를 도입하여 생산된 에탄올과 유리된 자유지방산의 트랜스에스테르화 반응을 통해 FAEE 를 생산하였다. 이와 더불어 Rhodococcus opacus에 코돈 최적화 된 Synechococcus elongates PCC7942 acyl-ACP reductase 와 aldehyde decarbonylase 를 이용하여 long chain hydrocarbon 의 생산 역시 성공하였다.
친환경적이며 재생 가능한 바이오 기반의 생산 시스템 구축은 생물체 내의 대사 회로를 다양한 분자생물학 기술을 통해 조절함으로써 대사의 흐름을 목적 물질을 생산에 최적화하여 얻어질 수 있는데, 우선 목적 물질의 생산에 필요한 대사 흐름을 강화시키기 위해 그와 관련된 효소의 발현을 증가시키는 것과, 세포의 성장 및 목적 물질과 경쟁 관계에 있는 대사 흐름을 막기 위해 해당 유전자의 결실을 유도하는 방법이 있다. 위에서 언급한 바와 같이 미생물을 이용한 바이오 연료 생산 분야에 가장 적합한 미생물임에도 불구하고 대사공학을 이용한 실험 기법들이 부재로 연구의 한계가 있다. 본 연구에서는 종래 Rhodococcus 내에서 유전자 결실방법의 한계점을 해소하고, 동시에 다수의 목적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 sRNA 를 제작하였다.
